正文
Genome-Shuffle-seq
技术的整体框架和操作流程
（Credit:
Science
）
A：在基因组中集成的loxPsym位点阵列如何在Cre重组酶的作用下，发生重组并生成三类主要的结构变异（SVs），包括缺失、倒位和易位。这些变异通过Cre介导的重组事件生成，从而在基因组中引入多种结构变异。
B：Shuffle cassette的结构，这是一种用于生成SV的构件。每个shuffle cassette包含一个loxPsym位点，两侧分别有独特的20个核苷酸条形码、用于捕获scRNA-seq数据的序列（CS1、CS2），以及在活细胞中不活跃但在体外转录（IVT）或原位转录（IST）时能被激活的噬菌体RNA聚合酶启动子。这些条形码和捕获序列能够精确标记每个变异事件，并为后续的基因组定位提供必要信息。
C：Genome-Shuffle-seq实验的工作流程。通过这种方法，shuffle cassette可以被随机或有针对性地整合到基因组中，并在细胞群体中引发结构变异。随后，通过IVT或IST技术获得转录数据，对这些变异进行定位和表征。
D：通过T7原位转录或体外转录序列来映射shuffle cassette的插入位置。每个插入点都通过唯一的条形码对进行标记，并与基因组中的特定位点关联。通过这些条形码，可以准确定位每个变异的发生位置。
E：通过条形码的组合，推断诱导的结构变异类型（如缺失、倒位、易位）。当Cre重组酶在细胞中介导变异时，新的条形码组合出现在这些变异的子集细胞中，通过与已知的父代条形码坐标结合，研究人员可以确定变异类型及其基因组定位。
Shuffle Cassette：基因组中的“卡片”重组
在Genome-Shuffle-seq技术中，“Shuffle cassette”作为核心构件，扮演着至关重要的角色。它不仅是生成结构变异（SVs）的工具，还通过其独特的设计和重组机制，实现在基因组中高效、精准地引入各种类型的变异，包括缺失、倒位和易位等。
Shuffle cassette本质上是一段包含多个功能模块的DNA序列，其中最关键的部分是loxPsym位点，这是一种可以被Cre重组酶识别并催化重组的特殊序列。通过将这类“洗牌盒”随机插入到基因组中，每个插入位点都带有独特的标记条形码。当Cre重组酶作用于这些位点时，它可以在同一细胞内驱动两个shuffle cassette之间的重组，生成不同类型的结构变异。具体而言，当两个盒子之间发生重组时，可能导致基因组的缺失（当两片段融合在一起）、倒位（片段方向颠倒）或易位（片段移到其他染色体上）等结构性改变。
这一过程的优势在于，重组事件是精确可控的，通过调整Cre酶的表达，可以在不同时间点诱导SVs的形成，这使得研究人员能够系统地生成大量不同类型的SV，而不需要借助传统的随机突变方法或耗时的细胞筛选。
更为独特的是，每个shuffle cassette的两侧都有两个20nt条形码（barcode），这使得每个插入位点都可以被独特标记。当这些条形码与基因组中的特定位置结合时，形成一个能够被精确追踪的标记系统。这些条形码不仅可以帮助标定SV事件的发生，还能通过高通量测序对每个变异的发生位置和频率进行分析。特别是在大规模的细胞群体中，条形码技术可以帮助研究人员快速识别和追踪不同类型的SV，这对于理解这些变异在细胞中的传播及其对基因功能的影响至关重要。
为了理解变异如何影响细胞的行为，尤其是它们如何在单细胞层面上与基因表达相互作用，Genome-Shuffle-seq技术通过与单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合，为研究人员提供了前所未有的高通量分析能力。
利用Shuffle cassette系统，研究人员能够在细胞群体中生成不同类型的结构变异，并通过条形码技术精确地追踪每个变异的位置。通过单细胞分离与RNA测序（scRNA-seq）结合，研究人员可以在每个单独细胞内检测其基因表达谱，并与对应的结构变异信息进行比对。这种结合不仅能够揭示每个细胞内的基因表达特征，还能帮助研究人员理解这些变异如何在细胞内引发功能性的变化。
在该研究中，研究人员采用了T7原位转录技术（IST）与scRNA-seq相结合的策略，使得每个细胞内的结构变异条形码可以与其转录组数据一同捕捉。通过这一方法，研究人员能够将每个细胞内的结构变异信息与其基因表达谱精确地关联起来，从而描绘出结构变异如何具体影响基因表达。在小鼠胚胎干细胞中，研究人员成功地对带有不同结构变异的细胞进行了单细胞RNA测序，发现那些带有特定SVs的细胞在基因表达上存在显著差异，尤其是在涉及细胞增殖、分化等重要生物学过程的基因上。
通过这种高通量和单细胞层面的分析，研究人员能够深入探讨结构变异对细胞功能的具体影响。特别是在癌症等复杂疾病的研究中，结构变异常常会导致基因的表达失调，这可能是肿瘤细胞增殖和转移的关键驱动因素。通过将结构变异与单细胞基因表达数据相结合，研究人员不仅能够揭示SVs如何影响单个细胞的行为，还能够理解这些变异在整个细胞群体中的动态演变。
