双重有效载荷ADC的偶联方法和注意事项

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）使用正交 aaRS/tRNA 对或单个双功能 ncAA 掺入两个 ncAA 。

（ d ） pAcF 和工程半胱氨酸的组合。

（ e ）在 HC 合成和 ADC 组装过程中，预偶联 LC 和引入 pAMF 的组合用于第二次有效载荷偶联。

（f ）使用 Xpress® 技术通过解耦 LC 生产和 IgG 合成实现 pAcF 和 pAMF 掺入。

（ g ） pAMF 和链间半胱氨酸偶联方法的组合。描述了 IgG 中参与偶联的氨基酸。蛋白质或接头有效载荷中氨基酸的反应性官能团以橙色和蓝色突出显示。蓝色或橙色的星号表示负载。

3. 通过 pAcF/pAMF 或 pAMF/ 链间半胱氨酸组合实现的均相双有效载荷偶联的示例

（ a ）将含有 LC 上 pAcF 和 HC 上 pAMF 的抗体偶联至单独使用氨基氧 -Alexa647 （泳道 1 ）、单独使用 DBCO-Alexa555 （泳道 2 ）、使用氨基氧 -Alexa647 和 DBCO-Alexa555 （泳道 3 ）。泳道 4-6 是泳道 1-3 中的减少样（ b ）通过亚基 LC-MS 分析证实了肟连接和 SPAAC 的偶联效率和正交性

（ c ）亚基 LC-MS 分析证实 DBCO 接头有效载荷 1 （ LP1 ）与 HC 上的 pAMF 偶联，然后马来酰亚胺接头有效载荷 2 （ LP2 ）与链间半胱氨酸偶联，产生 DAR12 （ 4LP1 ， 8LP2 ）双有效载荷 ADC 。图 i 、 ii 和 iii 分别是

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