Nature Biotechnology | ENTER问世：会“变身”的弹性蛋白纳米粒，打破细胞递...

生物探索 · 公众号 · 生物 · 2025-05-22 16:35

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研究团队利用ELPs的这一特性，设计了一种四嵌段ELP聚合物。想象一下它像一列有不同车厢的“列车”：一个亲水块 (hydrophilic block)作为“车头”，让纳米粒在水溶液中稳定；一个交联块 (cross-linking block)便于后续修饰；最重要的，一个疏水块 (hydrophobic block)作为“货舱”，以及一个特殊的内涵体逃逸块 (Endosomal Escape Peptide, EEP)作为“秘密武器”。当ELPs浓度超过一定值，并且温度适宜时（比如我们的体温37℃），这些ELP链就会自组装，亲水块朝外形成纳米粒的“外壳”，疏水块和EEP则藏在“核心”。

迭代优化：构建“聪明”的细胞快递员

研究团队的ENTER系统不是一蹴而就的，而是经过了四代（V1到V4）的迭代设计。

V1-ELP：最早的ELP系统，主要用于细胞外的药物递送，可以通过sortase酶（一种细菌转肽酶）将带有LPETG序列的蛋白连接到ELP上。实验显示，V1-ELP形成的纳米粒直径约60纳米，能被HeLa和HEK293细胞内吞，但需要氯喹（chloroquine，一种已知能促进内涵体逃逸的药物）的帮助才能实现蛋白递送（荧光蛋白递送效率在氯喹辅助下从接近0%提升到接近30%）。这表明V1-ELP能进入细胞，但内涵体逃逸能力不足。

V2-ELP：为了增强内涵体逃逸，研究者在ELP的疏水块中引入了组氨酸（histidine）。组氨酸在酸性环境下会质子化，增加亲水性。他们的设想是，当纳米粒进入酸性的内涵体时，组氨酸质子化会导致“货舱”的疏水性降低，“列车”解体，从而帮助“货物”逃逸。V2-ELP在pH值低于6时确实显示出胶束解体的现象。在HEK293-RFP（含有loxP-stop-loxP-RFP基因，Cre重组酶介导重组后会表达红色荧光蛋白RFP）细胞中，V2-ELP递送Cre蛋白（一种介导基因重组的酶，可用于验证细胞递送效率）的能力比V1-ELP有所提升，尤其是在氯喹存在的条件下（RFP阳性率从约10%提升到超过50%），这证实了组氨酸的作用，但仍需要氯喹辅助。

V3-ELP：进一步引入了EEPs。研究者在V2-ELP的N端（亲水块的“车头”）融合了五种不同的EEPs，包括Tat、S10等已知的内涵体逃逸肽。这些V3-ELP能形成稳定的纳米粒。在HEK293-RFP细胞中测试递送Cre蛋白时，带有S10或Tat EEP的V3-ELP效率最高，可以在浓度为16微摩尔ELP时实现约30%的RFP阳性率，但在这个浓度下观察到一定的细胞毒性。同时，他们还测试了不同的蛋白连接子（linker），发现一种对弗林蛋白酶（furin）敏感的连接子（GGSGGSRVRRGGSGGS）能提高Cre蛋白释放效率，这是因为弗林蛋白酶在内涵体中活跃。然而，N端融合的EEP暴露在外，可能会导致细胞膜破坏，从而产生毒性。

V4-ELP：为了降低毒性并更好地利用EEP，研究团队进行了关键的改进。他们将EEP移到了ELP的C端（疏水块的“车尾”），这样在自组装成纳米粒时，EEP会隐藏在疏水核心内部，被亲水外壳屏蔽。他们推测，只有当纳米粒进入内涵体、组氨酸质子化导致“货舱”解体后，藏在内部的EEP才会暴露出来，发挥内涵体逃逸功能，从而降低对细胞膜的非特异性破坏。同时，为了避免C端带正电的EEP与N端带负电的亲水块之间的静电吸引影响自组装，他们将N端亲水块中的谷氨酸（glutamic acid，带负电）替换成了丙氨酸（alanine）和甘氨酸（glycine），形成了新的V4-ELP结构。V4-ELP形成了直径约70纳米的单分散球形胶束纳米粒，负染透射电镜图像也显示了约30纳米的球形颗粒。

打开细胞大门：内涵体逃逸肽的寻觅与突破

尽管V3-ELP中的S10等EEP已能提高递送效率，但毒性仍是限制。V4-ELP的设计理念正是为了屏蔽EEP毒性。为了找到更强大的EEP，研究团队进行了一次大规模的计算模拟 (in silico screening)和体外筛选 (in vitro screening)。

他们首先构建了一个机器学习模型，基于已知内涵体逃逸肽的理化性质、结构特征和组成（如疏水矩、净电荷、两亲性α螺旋等），预测其递送效率。这个模型在测试数据集上的均方根误差（r.m.s.e.）为12.4，预测效果良好。随后，他们利用这个模型筛选了一个包含超过11000个α螺旋肽段的数据库。第一轮筛选发现一些候选肽段（如EEP5），但它们在V4-ELP平台上的Cre蛋白递送效率不如S10（S10在8微摩尔ELP浓度下使约44.1%细胞RFP阳性，EEP5仅约25.7%）。注意到表现较好的EEP（如EEP1和EEP5）富含赖氨酸（lysine），这可能是一个重要线索。

受此启发，他们进行了第二轮基于模型的筛选，重点寻找富含赖氨酸的α螺旋肽段。这次筛选取得了重大突破！他们发现了EEP13和EEP14等几个候选肽段，在V4-ELP平台上递送Cre蛋白的能力显著优于S10。尤其是EEP13，是一种由两个合成的抗菌肽组成的二聚体（通过GGSGGGS连接）。在HEK293-RFP细胞中，V4-ELP-EEP13在低至100纳摩尔的Cre蛋白剂量下（同时使用8微摩尔ELP）就展现出卓越的递送能力。单独比较V4-ELP-S10和V4-ELP-EEP13在不同ELP浓度下的性能，V4-ELP-EEP13显示出更高的最大递送效率。相较于基准肽S10，EEP13在计算模型预测的GFP递送效率上提升了48%。这项发现印证了通过屏蔽EEP毒性来发现更高效EEP的策略是可行的。

研究团队还通过用巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1，一种抑制内涵体酸化的药物）预处理细胞的实验证实，ENTER递送Cre蛋白的效率会显著降低，这强有力地支持了ENTER的内涵体逃逸机制依赖于内涵体酸化和组氨酸的质子化。

精准投递：蛋白质与基因编辑工具的实验成果

确定了优秀的纳米粒设计（V4-ELP-EEP13）和高效的EEP，接下来就是看它的实际递送能力了。

蛋白质递送：

HEK293细胞： V4-ELP-EEP13递送Cre蛋白的效果优于单独的S10肽段（在相似RFP阳性率下，所需ELP剂量比单独S10肽段低20倍以上）。与商品化的脂质体转染试剂Lipofectamine 3000相比，V4-ELP-EEP13在递送Cre蛋白方面表现相似甚至更优。这表明ENTER是蛋白质胞内递送的有效载体。

原代细胞：递送系统能否用于原代细胞是衡量其潜力的关键。研究团队在多种原代细胞中测试了V4-ELP-EEP13递送Cre蛋白的能力，这些细胞来自报告小鼠（Ai9小鼠，Cre重组酶介导基因重组后会表达红色荧光蛋白tdTomato）：