Nature | 破解DNA复制的密码：人类MCM双六聚体加载机制的首次全面解析

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完成阶段，保护片段缩短至55 bp，显示额外接触区域的消失。

冷冻电子显微镜（Cryo-EM）

冷冻电镜技术提供了原子级别的分辨率，帮助研究人员直接观察到 人类微管状复制复合体的双六聚体（human MCM Double Hexamer， hDH ） 加载的分子结构，包括六聚体之间的结合方式、DNA解旋的精细过程及ATP酶的活性位点分布。

人类MCM双六聚体（hDH）加载的重构实验 （Credit: Nature ）

该图展示了重建人类MCM双六聚体加载过程的实验设计、关键技术和主要结果，具体分为以下几个部分：

蛋白纯化和检测 （图a） 实验中使用了全长蛋白和N端非结构域（IDR）删除突变蛋白（∆N蛋白），包括： ORC1–5复合体（含ORC1(∆N)）， CDC6(∆N)和CDT1(∆N)。 纯化的蛋白通过SDS-PAGE电泳分离后用考马斯蓝染色，左侧为全长蛋白，右侧为∆N突变蛋白，显示各蛋白的纯度和表达情况。 结果验证了重组蛋白的制备质量，确保后续实验的可靠性。

核酸酶保护实验流程 （图b）

核酸酶保护实验用于检测MCM加载过程中DNA与蛋白复合物的结合区域。实验中： 加载反应后用Benzonase酶切处理去除未保护的DNA； 用EDTA、SDS和蛋白酶K终止反应； 通过苯酚-氯仿-异戊醇提取纯化剩余DNA； 将DNA分离后通过TBE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，并用SYBR Gold染色检测。

时间依赖性实验 （图c） 对比了酵母和人类MCM加载反应的时间依赖性，分为两组： 上图（酵母MCM加载）， 加载过程中，保护的DNA片段在2-4分钟时开始形成，最终长度约为55 bp。 下图（人类MCM加载）， 类似地，在∆N突变蛋白条件下，人类MCM加载产生了约75 bp的保护片段，随后逐渐缩短为55 bp。 这表明两者在加载过程中均表现出时间依赖性，但人类系统存在更广泛的初始接触区域。

∆N蛋白与全长蛋白的比较 （图d和e） 图 d， ∆N突变蛋白的核酸酶保护实验，逐步去除关键蛋白（如ORC6、CDC6、CDT1）后观察保护片段的变化。 结果表明，缺失ORC6对hDH加载影响较小。 图e， 全长蛋白条件下的实验，显示ORC6存在时加载效率略高，但并非绝对必需。

全长与∆N蛋白的依赖性差异 （图f） 对比了全长蛋白和∆N蛋白在加载过程中对ORC6的依赖性。 结果表明： 在全长蛋白条件下，ORC6促进了加载； 而在∆N突变蛋白条件下，ORC6的加入反而抑制了加载。

不同蛋白截短对加载的影响

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