获诺奖的PIEZO1，如何调节肿瘤免疫治疗？

免疫检查点阻断 （ICB） 为治疗各种癌症提供了治愈的可能性，但实际临床治疗中却多因疗效有限而导致癌症复发。在这一瓶颈中，最重要的一环就是T细胞在免疫反应中的作用和调节。近期，兴起了一个研究领域是专注于T细胞的机械生物学。到目前为止，已经报道了多种 T 细胞的生物力学传感器。通常，T细胞识别机械信号并将其转导到下游生化反应中，导致T细胞活化或抑制，从而调节T细胞的细胞毒性。在免疫识别中，细胞毒性T细胞可以在靶细胞表面产生张力，以增强穿孔素介导的孔形成，最终靶向细胞进行破坏。而在遇到硬化的癌细胞时，细胞毒性T细胞也可以增加牵引力并增强其细胞毒性。

PIEZO1属于真核细胞中对机械力有反应的离子通道家族，如触觉和本体感觉。通过检测和转导机械线索，PIEZO1对动态环境变化进行细胞调整，并在调节先天免疫系统方面发挥重要作用。在适应性免疫反应过程中，PIEZO1 有助于 T 细胞的活化，并选择性地抑制调节性 T 细胞，但不抑制 CD4 T 细胞的效应功能。然而，关于PIEZO1如何调节活化的细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的作用知之甚少。

近日，中国医学科学院基础医学研究所药理学系的刘玉英研究员与北京大学工学院力学与工程科学系的熊春阳教授合作，报告了 PIEZO1 作为细胞毒性 T 细胞机械调节分子。当阻断PIEZO1激活时，T细胞介导的肿瘤细胞死亡在体外和体内均得到增强。作为对 PIEZO1 的响应，GRHL3增加 RNF114 的表达，随后影响 F-肌动蛋白网络，从而降低了牵引力。这一发现也在临床环境中得到验证，其中较高水平的 GRHL3 和 RNF114 与不良预后相关。作为一种免疫力学调节分子，靶向PIEZO1有望增强癌症免疫治疗的效果。

PIEZO1阻断增强T细胞细胞毒性：

在T细胞活化相关过程中，PIEZO1于幼稚和活化的T细胞中同时存在且在后者中含量要高得多。在与黑色素瘤B16（B16）细胞接触之前，使用PIEZO1拮抗剂（GsMTx4）或激动剂处理Pmel-1 T细胞受体（TCR）转基因CD8 T细胞。在PIEZO1抑制下，在肿瘤细胞中观察到更高水平的细胞凋亡，表明细胞毒性增强。将 Piezo1–shRNA Pmel-1 T 细胞与 B16 细胞共培养，发现 Piezo1 敲低也增强了 T 细胞的细胞毒性，证实 PIEZO1 抑制增强了 T 细胞毒性。

不同的机械刺激诱导T细胞的功能结果不同。高渗导致钙内流减少并增强T细胞细胞毒性，而剪切流、挤压或低渗应激对T细胞细胞毒性的影响要小得多。为了破译潜在的机制，试图确定导致T细胞毒性的多种信号通路的潜在变化。IFN-γ 和 TNF 的分泌以及颗粒酶B和穿孔素的产生均未在PIEZO1抑制下发生显着变化。在活化的 OT-1 CTL 与 OVA-B16 细胞的共培养中，检测到 CD107a 对PIEZO1激动剂和抑制剂的反应显着增加，但后者的反应更为明显。表明细胞毒性的增强可能是更高水平的脱颗粒的结果。因此，PEIZO1活性可能以非经典方式调节T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。此外，PIEZO1 在人 CD8 T 细胞中高度表达，表明这可能是一种保守的潜在机制。

图 阻断PIEZO1活性增强T细胞杀伤功能

阻断PIEZO1 可增强激活时的牵引力：

T细胞响应外部机械信号，调整施加在靶细胞上的细胞力，从而影响穿孔素介导的孔形成并改变细胞毒性。遇到质硬的癌细胞时，T细胞通过在免疫接触处积累F-肌动蛋白来施加更高的细胞力。使用牵引力显微镜（TFM）研究PIEZO1活性对T细胞活化后的生物力学特性影响。使用包被在聚丙烯酰胺凝胶上的抗CD3抗体激活细胞，通过量化由于嵌入凝胶中的荧光珠位移而导致的荧光信号变化来确定牵引力。活性T细胞对不同刚度的PAA凝胶施加不同的牵引力，且响应激活后牵引力显着增加。这与肿瘤特异性T细胞对靶细胞表现出明显更高的亲和力的观点一致。抑制 PIEZO1 特异性增强了小鼠 CD8 T 细胞施加的牵引力，证实了 PIEZO1 在作为 T 细胞生物力学调节分子。此外，敲低 PIEZO1 也显著增强了产生的牵引力，在小鼠T细胞中从~11 Pa转移到24 Pa，在人T细胞中从~8 Pa转移到12 Pa。同时发现细胞松弛素D破坏了牵引力的形成，还大大损害了T细胞的细胞毒性。这证实牵引力对于T细胞对肿瘤的细胞毒性至关重要。

图 PIEZO1阻断增强了T细胞的牵引力

阻断PIEZO1 增强 T 细胞免疫疗法：

与脾脏相比，肿瘤浸润T细胞中的PIEZO1水平显着增加。从CD45.1 OT-1 TCR小鼠中收集的活化CD8 T细胞用GsMTx4处理，然后转移到移植有OVA-B16肿瘤的C57BJ/6L小鼠中。TNF、IFN-γ或PD-1、TIM3 和 LAG3 表达变化不大，而CD107a亚群的大小显著增加，表明准备脱颗粒的T细胞比例更高。同时，在PIEZO1抑制下，肿瘤浸润CD45.1 T细胞的数量也显着增加。更重要的是，肿瘤浸润的T细胞施加了明显更高的牵引力（~14 Pa）。通过引入肿瘤特异性T细胞来抑制小鼠的肿瘤发展，抑制其PIEZO1可以显着增强肿瘤杀伤作用。PIEZO1 shRNA 也提高了 OT-1 CD8 T 细胞对抗 OVA-B16 肿瘤的效率，这与PIEZO1的化学抑制结果相当。总之，PIEZO1是一种真正的生物力学免疫调节分子，可以探索以提高基于T细胞的免疫疗法的效率。

在B16F10小鼠模型中的小鼠注射用GsMTx4预处理的Pmel-1 CD8 T细胞并接受抗PD-1抗体方案，或注射Pmel-1 CD8 T细胞并在T细胞转移后同时开始GsMTx4和抗PD-1治疗。GsMTx4单药治疗抑制了小鼠的肿瘤生长，延长了小鼠的生存期，而GsMTx4和抗PD-1抗体组合的治疗效果更好。

图 阻断PIEZO1促进CTL浸润并通过增强CTL的牵引力来减弱肿瘤生长

PIEZO1 通过 GRHL3和 RNF114 调节 T 细胞牵引力：

为了了解 PEIZO1 介导的活化 T 细胞牵引力调节机制，鉴定与 PIEZO1 活性相关的转录特征。从主成分分析和成对Spearman相关性的聚类中出现了一个独特的基因队列。其中，GsMTx4抑制PIEZO1的基因有14个上调，174个基因下调。特别是，GsMTx4抑制的功能在细胞运动、细胞粘附和细胞骨架组织中富集，表明存在连接PIEZO1活性和下游功能的潜在信号通路。因此，特别关注对GsMTx4 有反应的转录因子，以 Grhl3、Zfp618、Ybx2 和 Tead3 为代表。进一步使用预测差异表达或共表达基因集转录调控子的工具（Lisa，http://lisa.cistrome.org/)选定出了Hey1 和 Grhl3。

图 PIEZO1阻断下调GRHL3的表达

在抑制 PIEZO1 后，GRHL3 在小鼠和人 CD8 T 细胞中的表达显着减弱。PIEZO1的沉默也下调了GRHL3，强烈提示GRHL3位于PEIZO1的下游。此外，Grhl3敲低显著增强了T细胞牵引力，从~14 Pa增加到25-29 Pa。因此，PIEZO1依赖性生物力学调节很可能是由GRHL3介导的。

为了鉴定 GRHL3 下游靶标，进行染色质免疫沉淀，然后进行了测序 ChIP-seq 和 ATAC-seq 分析，从中发现 GRHL3 特异性占据了小鼠皮肤、人正常人表皮角质形成细胞和人 CD8 T 细胞中 RNF114 位点的启动子区域。更重要的是，在人和小鼠CD8 T细胞中敲低 PIEZO1，在转录水平和转录后水平上RNF114均明显降低。从而支持了PIEZO1-GRHL3-RNF114功能轴的可能性。此外，RNF114 敲低显着增强了依赖于 F-肌动蛋白聚合的 T 细胞牵引力。为了进一步验证这些发现，在 PIEZO1 敲低时通过过表达来升高 GRHL3 或 RNF114，发现这两种操作都逆转了 PIEZO1 对 F-肌动蛋白和牵引力的影响。总体而言，PIEZO1-GRHL3-RNF114可作为信号级联反应，通过重塑 F-肌动蛋白网络来调节 T 细胞的牵引力。

图 PIEZO1-GRHL3-RNF114通路调节T细胞的牵引力

靶向癌症中的PIEZO1-GRHL3-RNF114 通路：

将该发现扩展到临床，检查来自健康志愿者（n = 5-6）或结直肠癌（CRC，n = 10），胃腺癌（STAD，n = 6）或肝细胞癌（ HCC，n = 6）患者的CD8 T细胞中PIEZO1，GRHL3和RNF114的表达。所有三种蛋白质在患者来源的CD8 T细胞中都显着升高。其次，GRHL3 和 RNF114 的表达对GsMTx4 抑制 PIEZO1 仍然敏感，并与F-肌动蛋白网络的重塑有关。因此，与健康个体相比，癌症患者的T细胞牵引力作用显着降低，并且在浸润性T细胞中特别受损。因此，PIEZO1-GRHL3-RNF114信号转导调节T细胞对肿瘤的细胞毒性，因此对免疫治疗的疗效至关重要。总的来说，PIEZO1-GRHL3-RNF114 通路的异常变化是 CD8 T 细胞机械能力低下的潜在原因，这可能与癌症患者可能对免疫疗法反应不佳有关。

图 患者T细胞的牵引力受PIEZO1-GRHL3-RNF114通路的调节

CD8 T细胞肿瘤浸润不足是ICB免疫治疗肿瘤逃避的关键潜在因素之一。在小鼠模型中，PIEZO1信号阻断有效地改善了CD8 T细胞对肿瘤的浸润。基于Kaplan-Meier分析，观察到对 PD-1 免疫疗法或所有其他 ICB 疗法有响应的 GRHL3 低水平患者的预后更好。基于 TIMER 2.0 数据集，发现GRHL3表达与不同类型肿瘤中的CD8 T细胞浸润呈负相关，如结肠腺癌、肺腺癌或乳腺浸润性癌等。同样，较高的 RNF114 水平与PD-1 或CTL4 阻断免疫治疗的不良预后相关。因此，靶向 PIEZO1-GRHL3-RNF114 通路提供了一种最大限度地发挥癌症免疫治疗潜力的方法。

图 GRHL3或RNF114的表达与免疫治疗对多种人类癌症的总生存期均呈负相关

小结：

随着新证据的出现，学界开始认识到T细胞活化和杀伤作用中的机械生物学调控。PIEZO1 已被描述为促进 T 细胞活化的机械传感器，在影响 CTL 细胞毒性方面的作用已经被明确。在这项研究中，作者团队证明了阻断 PIEZO1 有助于活化的 T 细胞在体外和体内对靶肿瘤细胞进行攻击。这一发现不仅将 PIEZO1 定义为 T 细胞毒性的生物力学调节分子，而且还强调了与 T 细胞活性相关的生物力学特性的重要性。作者团队证明了 PIEZO1 激活上调转录因子 GRHL3，而转录因子 GRHL3 反过来又诱导影响 CD8 T 细胞中 RNF114 的表达。最终，RNF114重新排列F-肌动蛋白以降低T细胞施加的牵引力，从而抑制T细胞的杀伤功能。

免疫接触的形成是T细胞杀伤事件的先决条件，T细胞杀伤事件是由细胞-细胞界面的机械力驱动的。遇到抗原时，免疫细胞与抗原呈递表面结合并产生相当大的收缩反应。更强的牵引力似乎增强了T细胞抓住和攻击靶细胞的能力。PIEZO1阻断增强了T细胞牵引力，增强了T细胞对癌细胞的细胞毒性。作者团队发现了由PIEZO1调节的T细胞牵引力强度与肿瘤发生之间的密切关联。更具体地说，浸润肿瘤的T细胞似乎比邻近癌症组织中的T细胞施加的牵引力要小得多，但可以通过抑制PIEZO1来改善，这可能会产生更好的临床结果。

目前仍然不确定牵引力的下调是否是延长免疫反应的T细胞活性调节的一部分，或者是否是由于肿瘤中的生态位环境诱导。另一关键问题是PIEZO1相关机械调节在其他关键参与者（如记忆T细胞）中的作用。此外，仍然需要探索 CTL 中 PIEZO1 和相关信号传导/效应组分的亚细胞分布，特别是沿着发生裂解作用和细胞间通讯的免疫突触，因为效应 CTL 在遇到细胞靶标时在组织和功能上高度极化。总体而言，这项研究将有助于极大地扩展对T细胞如何在不同生理和病理环境的微环境中感知和响应机械应力的认知，从而可以发现更加有效的治疗靶点。

参考文献：

Ruiyang Pang, Weihao Sun, Yingyun Yang, et al. PIEZO1 mechanically regulates the antitumour cytotoxicity of T lymphocytes. Nat Biomed Eng. 2024 Mar 21.

https://www.nature.com/articles/s41551-024-01188-5

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