单细胞加空转，揭示HRD和非HRD三阴乳腺癌肿瘤微环境差异！

小伙伴们大家早上好，今天小编和大家分享的这篇文章是近期发表在《Computers in Biology And Medicine》（IF:7.7）,本篇文章主要对三阴性乳腺癌(TNBC) 同源重组缺陷(HRD)和非HRD进行了比较TNBC是乳腺癌侵袭性最强的亚型，其HRD比例最高。HRD一直被认为是免疫检查点抑制剂(ICIs)反应的生物标志物，对HRD和非HRD TNBC样本的肿瘤微环境(TME)进行综合比较可能是有帮助的。今天让我们一起来学习一下这篇文章吧！

1.HRD和非HRD样本单细胞图谱

数据：GSE161529：包括4个HRD和4个非HRD样本的单细胞测序数据；TCGA下载体细胞突变谱、FPKM类型的转录组数据以及乳腺癌和卵巢癌患者的临床特征（图1A）。对8个TNBC样本的单细胞数据进行分析，通过质量控制和细胞注释，标记基因识别出上皮细胞、免疫细胞和基质细胞。免疫细胞初步分为T/NK细胞、B/浆细胞、髓系细胞、浆细胞样树突状细胞和柱状细胞。比较两组细胞类型的分布，HRD组免疫细胞和基质细胞的百分比较高(图1B)。就免疫细胞而言，HRD组中B/浆细胞的百分比较高，而髓系细胞的百分比较低。

图1：HRD和非HRD样本的单细胞图谱

2. 非HRD组的T细胞表现衰竭的表型

将T/NK细胞根据标记基因注释成9种细胞类型如图2A-B。CD4⁺Tex、CD8 ⁺Tex和Treg细胞的百分比在非HRD组中更高，有更高功能失调的表型(图2C)。CD4⁺T细胞的拟时序分析显示了从CD4⁺ Tn到CD4⁺Tex或Treg(图2D)。发育轨迹上标记基因表达水平的差异显示CTLA4和TIGIT在到Treg的轨迹上表达更高。同时对CD8⁺Tem、Teff和Tex进行了拟时序分析，结果显示衰竭和分化轨迹之间存在明显的关系(图2E)。

CD4⁺和CD8⁺亚型的Tex细胞增殖评分均较高(图2F)。CD8⁺Teff细胞毒性评分最高，细胞杀伤功能最强。CD8⁺T细胞的细胞毒性评分和naïveness评分呈负相关，与更多naïve T细胞的细胞杀伤功能较低相一致。比较两组的特征得分，发现在非HRD组中，CD4+和CD8+细胞的衰竭和增殖得分显著更高，而HRD组CD4⁺T细胞naïveness评分和CD8+ T细胞毒性评分显著升高(图2G)。

研究了CD8⁺Tem、Teff和Tex细胞的衰竭评分和拟时序之间的关系。拟合曲线显示，非HRD组的衰竭评分上升更快(图2H)。进一步确定在非HRD组一个更功能失调的表型的潜在机制，CD8⁺T细胞表达TOX(编码T细胞衰竭关键TF的基因)的比例在非HRD组较高(图2I)。同时，发现CD8+Tex前体表达TCF7，编码TCF-1基因。Tex细胞维持肿瘤的长期免疫反应，并在抗PD -1治疗后增殖。HRD组的Tex细胞比例较高，表明对ICI治疗的反应较好(图2J)。两种TFs的分布解释了两组间T细胞表型的差异。

与CD8⁺ T细胞相比，非HRD组NK细胞的细胞毒性评分显著高于CD8⁺T细胞(图2K)。GSEA富集分析显示，细胞毒性增强与非HRD组代谢相关通路富集一致，如氧化磷酸化、脂肪酸代谢和mTORc1信号通路(图2L)。

图2：HRD和非HRD样本中T/NK细胞的特征

3. HRD组TAMs功能增强，非HRD组DCs表型耐受性更强

髓系细胞分为FCN1⁺单核、CCL3L1⁺单核、SPP1⁺TAM、C1Qs⁺TAM、包括cDC1、cDC2、LAMP3⁺DC在内的经典DC (cDC)和Langerhans细胞(LC)(图3A)。作为两种截然不同的TAMs表型，SPP1⁺TAMs表达SPP1、FN1和血管生成相关基因VCAN、VEGFA，而C1Qs ⁺TAMs表达C1Qs、APOE、TREM2和SLC40A1(图3B)。由C1QA/B/C编码的补体C1q增强吞噬细胞作用，抑制巨噬细胞炎症。虽然SPP1⁺TAM和C1Qs ⁺TAM的亚型比例在两组间存在差异，但总体比例差异不明显(图3C)。单核细胞和TAMs的拟时序分析显示，两种TAMs可能通过不同的轨迹从单核细胞分化而来(图3D)。结合轨迹和细胞比例，作者推测两组单核细胞的分化倾向应该相似。

TAMs的M1和M2分别代表促炎和抗炎作用，M1和M2相应的特征得分在C1Qs ⁺TAM3簇中最高，在SPP1⁺TAM3簇中最低(图3E)。M1和M2得分显著正相关，进一步显示了TME中TAMs的复杂表型(图3F)。SPP1⁺TAMs血管生成评分较高，C1Qs⁺TAMs吞噬评分较高(图3E)。吞噬评分最高的簇C1Qs⁺TAM 5特异性表达LYVE1，与抗炎和纤维化相关的巨噬细胞标记物(图3B)。血管生成和吞噬细胞作用得分之间存在显著的负相关 (图3G)。HRD组的M1、M2、血管生成和吞噬功能评分均显著高于非HRD组，说明HRD可以全面增强TME中TAMs的功能(图3H)。

进一步分析了DC的功能和表型，比较两组差异，拟时序结果显示LAMP3⁺DC可能由cDC1和cDC2通过不同的发育轨迹演化而来(图3I)。在cDC和pDC中评估了激活、迁移和耐受签名，所有签名在LAMP3⁺ DC中最高(图3J)。在cDC中，这些得分与拟时序之间的关联显示了类似的趋势(图3K)。激活得分与耐受性和迁移得分呈正相关(图3L)。比较DCs的特征得分，激活和耐受评分在非HRD组显著更高(图3M)。

图3：HRD和非HRD样本的骨髓细胞特征

4. 在HRD组发现一组功能失调的B细胞

发现了一种特殊的缺乏IGHG1、IGHD和IGHM表达的亚型(图4A)。IRF8是该亚型的一个标记物，在无效B细胞中高表达(图4B)。由于缺乏免疫球蛋白相关基因的表达，该亚型可能缺乏B细胞受体和分泌功能，被归类为无效B细胞。HRD组主要发现无效B细胞(图4C)。利用功能分析探索B细胞亚群功能的异质性，除无效B细胞外，其他两种亚型B细胞的功能均富集于B细胞激活通路、B细胞受体信号通路和抗原受体介导的信号通路(图4D)。

5. 上皮细胞中基因表达的异质性和富集的通路

与免疫细胞和基质细胞相比，上皮细胞在不同样本中存在显著差异，表明样本之间存在异质性(图4E)。根据使用inferCNV包对上皮细胞进行CNA的估计，几乎所有的簇都有明显的拷贝数变化，符合肿瘤细胞的特征(图4F)。在后续的分析中，所有上皮细胞都被视为肿瘤细胞。不同簇的肿瘤细胞具有不同的标记基因，有一簇特异性表达MUCL1和Epi 23，Epi 23主要在非HRD样本中被发现。MUCL1编码乳腺小上皮粘蛋白，该蛋白被发现通过加速上皮细胞向间质转化来促进乳腺癌的侵袭和转移(图4F)。根据基因表达矩阵的前100个主成分计算每个样本的异质性，肿瘤间和肿瘤内异质性之间存在明显的正相关(图4G)。与非HRD组相比，HRD组异质性得分趋于降低，但结果不显著(图4H)。参与人类白细胞抗原I类(HLA-I)的基因表达水平，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C和B2M，在HRD样本中是不一致的，表明肿瘤细胞的抗原呈递能力可能存在缺陷(图4I)。以HLA-A为例，平均表达水平与免疫细胞比例呈正相关(图4J)。尽管HRD样本总体上有较高比例的免疫细胞，但样本之间存在差异。

图4：HRD和非HRD样本中B细胞和上皮细胞的特征

6.两组有独特的CAFs表型

将基质细胞分为正常成纤维细胞(NFs)，肌成纤维细胞CAFs (myCAFs)，炎症样CAFs (iCAFs)，周细胞和内皮细胞(图5A)。与NFs相比，myCAFs有更高的平滑肌相关基因表达，而iCAFs有更高的趋化因子基因表达 (图5B)。在两组中，主要的CAF类型分别是myCAF和iCAF(图5C)。拟时序分析发现这两种类型的CAFs可能是通过不同的分化轨迹从NFs分化而来 (图5D)。作者提出了HRD诱导CAFs向iCAFs分化的潜在机制：HRD导致DNA损伤反应，激活持续的NF-κ b信号从而增强的IL-1α的旁分泌作用促进JAK/STAT信号通路，进一步诱导CAFs的炎症表型，这在胰管腺癌中有报道。TFs，如NFKB1和STAT3，在iCAFs中被激活(图5E)。此外，通过NF-κB和IL6/JAK/STAT3信号通路的TNFa信号通路在iCAF中富集，这与先前的假设一致(图5F)。对于非HRD组中占主导地位的myCAFs, TGF-β信号通路被报道可以促进myCAF表型，这与TGF-β信号通路在myCAFs中的富集一致(图5F)。此外，上皮-间充质转化和顶端连接通路在myCAFs中富集，表明myCAFs可能促进肿瘤的转移(图5F)。在TCGA的TNBC样本中，利用myCAFs标记基因集通过ssGSEA计算富集评分，发现与较差的预后显著相关(图5G)。HRD可重组TME中CAFs的表型，减少myCAFs对不良预后的影响。

图5：HRD和非HRD样本的基质细胞特征

7. HRD组特有的血管生成细胞-细胞相互作用和非HRD组特有的DPP4趋化因子

比较两组细胞类型比例的差异，非HRD组上皮细胞、CD8⁺Tex的含量远高于HRD组，HRD组中大部分免疫细胞和基质细胞的比例较高。免疫细胞和基质细胞含量之间的相关性显示(图6A)，CD8⁺Tex、CD4⁺Tex、LAMP3⁺DC和Treg之间存在明显的正相关。此外，iCAF比例与CD8⁺Tex、LAMP3⁺DC和Treg呈负相关， iCAF可能具有抑制T细胞衰竭的功能。利用Cellphonedb研究细胞之间的通讯，两组之间显著的通讯中HRD组涉及的细胞数量和类型更多(图6B)，发现参与最多的细胞类型是myCAF、iCAF和内皮细胞，为了比较两组间的细胞通讯，选择了仅在两组显著的相互作用，由于两组间CAFs的表型不同，重点研究了非HRD组的myCAFs和HRD组的iCAFs之间的相互作用。

在HRD组，iCAFs与上皮细胞之间存在特殊的相互作用，包括NOTCH2-DLL3、EGFR-TGFA和FGFR1/TIMP1/FGF7/ CD44-FGFR2，表明iCAFs以多种方式激活肿瘤细胞内的通路。iCAFs与内皮细胞的相互作用在HRD组中发现与血管生成相关的VEGFD-KDR / FLT4，表明iCAFs具有血管生成作用(图6C)。在非HRD组中，特异性相互作用主要与DPP4有关。DPP4是一种丝氨酸蛋白酶，可以结合细胞膜或溶解在血浆中，能够从蛋白质中去除前两个氨基酸，包括几种趋化因子，从而调节其功能(图6D)。总的来说，这些结果提示了HRD组免疫细胞含量增加的一个潜在原因 (图6E)。HRD依次激活NF-κB信号通路和JAK/STAT信号通路，将主要CAF表型重新编程为iCAF。与myCAFs相比，icaf中DPP4的产生减少，因此保持了趋化因子招募免疫细胞进入TME的能力。

图6：HRD和非HRD样本中的特定细胞-细胞相互作用

8. 基于空间RNA-seq的细胞类型之间的位置关系

图7：空间上细胞类型之间的关系

9. 与DPP4相关的ICI治疗反应预测模型的建立

比较了来自TCGA的TNBC样本中DPP4的表达水平验证scRNA-seq中的结果，HRD高组样本的表达水平低于HRD低组(图8A)。HRD评分与免疫功能障碍评分呈显著负相关，但与免疫排斥评分无显著负相关(图8B)。根据细胞与细胞之间的相互作用，DPP4可能是调节TME中免疫细胞含量的重要因素。基于蛋白-蛋白相互作用，鉴定了51个DPP4相关基因。使用六种机器学习算法(图8C)，通过五次交叉验证，在训练和验证集中构建并优化预测模型。通过比较验证集中6个模型的性能，发现XGBoost模型的AUC最高，并用于后续分析(图8D-E)。经过调优XGBoost模型在测试集中的AUC为0.67 (图8F)。测试集中这个模型AUC达到了0.80 (图8G)。此外，在将样本分为高、低反应组后，探讨了TCGA模型对非ICIs人群预后的预测性能。在TNBC中，两组间的总生存期有不达到统计学意义的趋势，可能受高应答组样本量的限制。在HRD比例相似的乳腺癌和卵巢癌中，反应高组的总生存率显著提高(图8H-I)。

与HRD评分不同，预测的反应与功能障碍得分呈正相关，但与排除得分呈负相关(图8J)。对于大多数免疫细胞类型，高应答概率组ssGSEA评分显著较高，也包括Treg、LAMP3+ DC等具有免疫抑制作用的细胞类型(图8K)。

图8：与DPP4相关的ICI治疗反应预测模型的建立

小结

本文从多组学数据入手，scRAN-seq、空间转录组学、RNA-seq三种数据进行分析，在非HRD组中发现了T细胞的耗竭表型和CD细胞的耐受性表型。HRD将CAFs的主要表型从肌成纤维细胞的CAFs改变为炎症样CAFs。由于肌成纤维细胞CAFs和其他细胞之间的相互作用，DPP4趋化因子与减少免疫细胞招募在非HRD组中是独特的。基于DPP4相关基因的预测模型在预测反应、预后和免疫细胞含量方面具有良好的性能。在RNA-seq测序样本中，较高的HRD评分表明更激活的免疫细胞功能。

本篇文章最大的亮点在于，重点研究了非HRD组的myCAFs和HRD组的iCAFs之间的相互作用，本篇文章的研究不仅利用scRAN-seq分析出显著的互作对，而且也利用空间转录组数据研究相对位置的关系，这种分析更加的具有说服力，因为在scRAN-seq层面上互作具有统计学意义，但是有可能两个细胞会距离太远互作并不像统计学上那么显著！

【参考文献】

Homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancer:

Multi-scale transcriptomics reveals distinct tumor microenvironments and

limitations in predicting immunotherapy response

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