正文
。研究人员将ADAR2去氨酶分成两个无催化活性的片段——N端片段 (Q316-A468) 和 C端片段 (D469-T700)，分别与pMag和nMag-dCas13融合。
示意图
（Credit:
Nature Biotechnology
）
这样一来，在没有蓝光照射的情况下，分裂的ADAR2去氨酶片段无法“合体”，PA-rABE处于“关闭”状态，不进行RNA编辑。而当给予蓝光照射后，pMag和nMag“手牵手”，将分裂的ADAR2去氨酶片段重新组装成具有功能的酶，PA-rABE瞬间被“激活”！此时，在crRNA (CRISPR RNA) 的引导下，PA-rABE精准地靶向目标RNA，并催化腺嘌呤 (A) 到 肌苷 (I) 的碱基转换，从而实现RNA的精准编辑。肌苷在生物化学上被识别为鸟嘌呤 (G)，因此A-to-I编辑实际上导致了功能上的A-to-G转换。
为了验证PA-rABE的RNA编辑效率，研究团队构建了一个高斯荧光素酶 (Gaussia luciferase, Gluc) 报告基因。这个基因包含一个琥珀密码子 (TAG)，导致Gluc蛋白翻译提前终止。只有当Gluc W160X转录本被成功编辑，UAG被转换为UIG，才能恢复Gluc的正常翻译，产生荧光信号。
研究人员首先比较了基于不同dCas13蛋白 (dCas13b, dCas13d, dCas13X, mini dCas13X) 的PA-rABE系统的活性。荧光素酶检测结果显示，mini dCas13X-ADAR2ddc-nMag 和 pMag-ADAR2ddN 的组合在HEK293T细胞中表现出最高的报告基因活性。 接着，研究人员又评估了11对具有不同分裂位点的ADAR2dd片段修复Gluc W160X的能力。结果发现，分裂位点在 E466/P467 的片段对显示出最高的光诱导激活 (2.9倍)。为了进一步降低ADAR2dd自发重组的可能性，研究人员使用了分裂萤火虫荧光素酶检测方法，结果表明，E466/P467位点的分裂诱导的自发重组水平最低。综合考虑激活效率和背景活性，研究团队最终选择了 Q316-E466 (N端片段) 和 P467-T700 (C端片段) 的ADAR2dd片段，用于PA-rABE的构建。
PA-rABE：高效、精准、可逆的RNA编辑“瑞士军刀”！
为了进一步优化PA-rABE的性能，研究团队对PA-rABE的结构配置进行了深入研究。他们测试了分裂的ADAR2dd片段、Magnets和mini dCas13X之间的相对方向，共测试了八种不同的配置组合。令人惊喜的是，nMag-ADAR2ddc 与 mini dCas13X-ADAR2ddN-pMag 的组合，展现出最强的光诱导荧光素酶活性，活性提高了5.1倍！
连接蛋白的柔性连接肽对于融合蛋白的功能至关重要。研究人员测试了九种不同的柔性或刚性连接肽，发现L2 (GSGGGGS) 连接肽产生了最低的背景和最高的诱导比率。 进一步优化L2连接肽的长度，L2-4 (GSGGGG) 变体成为最佳选择，诱导倍数高达19.2倍！ 为了进一步提高编辑效率，研究人员探索了先前研究中鉴定的ADAR2dd突变体。E488Q/Q421R双突变体比E488Q单突变体更有效 1.2倍。
此外，研究人员还发现，在crRNA的两侧加入双直接重复序列 (dual DRs)，可以将荧光素酶活性提高三倍！因此，双DRs被选为后续实验的guide RNA设计。 研究团队还评估了Magnets系统的不同变体，发现 nMagH 变体与 mini dCas13X-ADARddN-pMag 组合，产生了最高的诱导倍数 (47.2倍)，同时背景活性最低。 为了测试核定位信号 (NLS) 或核输出信号 (NES) 对PA-rABE系统性能的影响，研究人员将NLS或NES融合到mini dCas13X蛋白的N端或C端。结果发现，NLS融合到mini dCas13X的两个末端，PA-rABE的光诱导荧光素酶活性最高。
与传统的RNA编辑系统 (mxABE, REPAIRv2, REPAIRx) 相比，PA-rABE对Gluc W160X和mCherry W98X报告基因靶点都显示出卓越的编辑活性。更重要的是，与最近报道的padCas13编辑器相比，PA-rABE在光照下的编辑效率和诱导比率更高。值得注意的是，在crRNA存在的情况下，转染PA-rABEN 或 PA-rABEC 载体的细胞中未检测到荧光素酶报告基因活性，而转染padCas13编辑器 (具有完整ADAR2dd) 构建体的细胞则诱导了相当大的背景报告基因活性。当padCas13编辑器中的ADAR2dd被替换为无活性的ADAR2dd-E396A变体或截短的ADAR2dd时，背景活性消失，这表明padCas13编辑器较高的背景活性主要是由于完整的ADAR2dd引起。
这些数据充分证明，经过多轮优化后的PA-rABE系统，在编辑效率、诱导倍数和背景活性控制方面都达到了非常优秀的水平，堪称RNA编辑领域的“瑞士军刀”。
神奇的光控开关：PA-rABE如何“点亮”基因治疗？
为了更深入地了解PA-rABE的工作特性，研究团队对其在体外细胞中的编辑活性进行了全面表征。他们发现，crRNA的长度和A-C错配在RNA-crRNA双链体中的位置，对RNA编辑效率有显著影响。PA-rABE的最佳crRNA长度为50-60 nt，而将A-C错配置于20-30区域可获得高编辑效率。PA-rABE的编辑效率与转染质粒的总量呈正相关。
研究人员还评估了PA-rABE在Gluc报告基因变体中所有16种5'-NAN (N = A 或 C 或 G 或 U) 三联密码子中的靶向灵活性。下一代测序 (NGS) 结果表明，PA-rABE能够编辑几乎所有motif，效率各异，其中UAN是最优选的，GAN是最不优选的，这与已知的ADAR偏好一致。 鉴于mini dCas13X可以处理其自身的CRISPR阵列，研究人员设计了靶向mCherry W98X和zsGreen W93X的crRNA作为CRISPR阵列。流式细胞术分析表明，使用CRISPR阵列同时靶向两个转录本的效率与单个crRNA相当，表明PA-rABE适用于多靶点编辑。
PA-rABE对光照非常敏感，即使在极弱的光诱导 (0.01 mW cm⁻²) 下，荧光素酶报告基因也能被高度激活。随着光照时间的延长，荧光素酶活性的恢复增加，而光照 (0.25 mW cm⁻²) 甚至在长时间光照下也不影响细胞增殖和活力。更令人惊喜的是，当撤去光刺激后，PA-rABE介导的RNA编辑会逐渐恢复到静息状态，表明PA-rABE系统具有良好的可逆性和重复刺激响应能力。
为了评估PA-rABE的空间特异性，研究人员使用3D打印的掩模覆盖培养皿，从下方用蓝光照射细胞。结果显示，mCherry W98X报告基因的表达在与掩模精确匹配的区域成功恢复，证实PA-rABE能够实现高空间分辨率的RNA碱基编辑。
