Cell | 解密DNA的“朋友圈”：新型光交联技术精准捕获DNA直接结合蛋白质

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创新纯化流程：XDNAX的精妙设计

光交联完成后，如何从复杂的细胞组分中高效、纯化地分离出与DNA交联的蛋白质，是这项研究成功的关键。研究团队为此开发了一套名为 “蛋白质交联DNA提取”（protein-crosslinked DNA extraction, XDNAX） 的多步变性纯化方案。

XDNAX流程的巧妙之处在于，它利用了经典的硫氰酸胍-苯酚-氯仿（TRIZOL）提取方法，最初用于核酸纯化。通过对TRIZOL中间相（interphase）的额外处理，研究团队能够有效去除大部分非交联蛋白质、核糖核酸、脂质（lipids）和其他细胞碎片。随后，他们对含蛋白质交联DNA的提取物进行超声破碎（ultrasonication），并通过高温变性（denaturing）和硅胶自旋柱（silica spin columns）的强力洗涤，进一步彻底去除残余的非交联蛋白质。最终，通过核酸酶（nuclease）处理将蛋白质从DNA上释放，并进行胰蛋白酶（trypsin）消化，以便进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析。

为了验证XDNAX的纯化效率，研究团队采用了稳定同位素标记细胞培养（SILAC）技术。他们将用重同位素（SILAC heavy）标记并经UVEN照射的MCF7细胞与用轻同位素（SILAC light）标记且未经照射的对照细胞混合，然后进行XDNAX处理。结果令人振奋：在所定量的1803种蛋白质中，有1026种蛋白质的富集倍数超过10倍，甚至有876种蛋白质仅在受照射的SILAC通道中被检测到，这表明背景非交联蛋白质几乎被完全清除。当省略4ST标记并使用未标记细胞进行相同的实验时，这种富集效果则完全消失，这进一步证明了XDNAX的特异性。

GO分析显示，在XDNAX后仅在受照射SILAC通道中发现的蛋白质，其核酸结合（nucleic acid binding）功能、特别是DNA结合（DNA binding）功能，富集度极高，p值分别达到了1E-149和1E-120。这与研究的预期高度一致。此外，研究团队还意外地在XDNAX样本中鉴定出了大量的核苷酸交联肽（nucleotide-crosslinked peptides），这些肽段在未经额外富集的情况下就能被检测到，为表征蛋白质-DNA相互作用界面提供了额外的证据。这项研究共发现了688个核苷酸交联肽，对应着379种不同的蛋白质——这一数字是此前报道的同类研究的20倍，标志着巨大的技术飞跃。其中，一个额外增加321Da质量的修饰（ phosphorylation of 4ST minus a water molecule）被确认为4ST交联的直接证据，这一修饰仅在受照射的样本中出现。

揭示基因组的“亲密图谱”：DNA互作蛋白质组的全面画像

这项研究首次绘制了人类乳腺癌细胞（MCF7 cells）中与DNA直接物理接触的蛋白质图谱，为我们理解基因组的复杂调控网络提供了前所未有的深度。

DNA互作蛋白质组的广度与组成

研究团队通过对五次重复实验的分析，共发现了1805种候选DNA互作蛋白质，其中有1191种在至少三次重复实验中稳定存在，形成了一个可靠的DNA互作蛋白质组（DNA interactome）核心列表。这个图谱与已有的深层细胞核蛋白质组（deep nuclear proteome）有很大的重叠，83%的蛋白质在细胞核中被检测到。

通过iBAQ（intensity-based absolute quantification）定量分析，研究发现，在DNA互作蛋白质组中，组蛋白（histones）仍然是丰度最高的蛋白质，对总iBAQ贡献最大，这符合组蛋白作为DNA骨架蛋白（scaffold proteins）的已知功能。此外，研究还发现：

功能多样性： 60%的DNA互作蛋白质具有核酸结合功能，特别是DNA结合和序列特异性DNA结合（sequence-specific DNA binding）功能。除了已知的DNA结合蛋白，研究还发现了层粘连蛋白（lamins）等细胞核骨架蛋白，以及大量参与染色质组织（chromatin organization）和细胞分裂（cell division）的蛋白质。

“未知”的力量： 令人惊讶的是，研究团队还鉴定出了一组278种无法归类到主要GO术语（main GO terms）的蛋白质，其中包括泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system）的成员，如PSM3，它们可能参与了细胞周期进程、细胞凋亡（apoptosis）和DNA修复中蛋白质的降解。更引人注目的是，其中一种未被表征的蛋白质C5orf24，其整个序列构成了一个未知功能的单一结构域（domain），并且高度无序。这提示我们，可能存在许多尚未被发现的、通过独特机制与DNA相互作用的蛋白质。

结构特性揭示：无序区域的关键角色

染色质在活细胞中表现出固态性质，为蛋白质和核糖核酸提供了核小体（nucleosome）支架，形成了一个弹性凝胶。研究团队深入探究了DNA互作蛋白质的结构特征，以了解它们是如何直接接触DNA的。

无序区域（Intrinsically Disordered Regions, IDRs）的普遍性： 这是这项研究最重要的发现之一。研究发现，DNA互作蛋白质组中的蛋白质表现出最广泛的内在无序性。与深层核蛋白质组和细胞质蛋白质组相比，DNA互作蛋白质的无序区域平均长度最长。数据显示，DNA互作蛋白质的无序区域平均长233个氨基酸，而甲醛交联染色质（formaldehyde-crosslinked chromatin）中的蛋白质平均长154个氨基酸，核内蛋白质平均仅有121个氨基酸，细胞质蛋白质更是只有49个氨基酸。这意味着，这些高度灵活、没有固定三维结构的无序区域，在蛋白质与DNA的“亲密接触”中扮演着至关重要的角色。

特定氨基酸重复序列的富集： 研究还发现，特定的同聚氨基酸（homopolymeric amino acid）序列（例如含有谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、赖氨酸和精氨酸的五肽序列）在DNA互作蛋白质中显著富集。数据显示，这些特定的五肽序列在DNA互作蛋白质中占36%的蛋白质，而细胞质蛋白质中仅占13%。这些重复序列通常与蛋白质的内在无序性相关联。

功能结构域（functional domains）的洞察： 研究团队还发现，许多经典的DNA结合结构域（DNA-binding domains）和组蛋白结合结构域（histone-binding domains），如PHD型（PHD-type）和C2H2型锌指（C2H2-type zinc finger）、SAP结构域（SAP domain）以及DEAD/DEAH盒解旋酶（DEAD/DEAH box helicase）等，在DNA互作蛋白质中显著富集。

意外的发现： RNA识别基序（RRM）与DNA的交集： 令人惊讶的是，通常与RNA结合相关的RNA识别基序（RNA recognition motif, RRM）结构域，也在DNA互作蛋白质中显著富集。研究团队能够识别出多个含有RRM结构域的蛋白质（如MATR3、TRA2B、SRSF2、SRSF11和RNPS1）与DNA的交联位点，这暗示了RRM结构域在活细胞中也可能与DNA相互作用。这可能是因为一些蛋白质在相分离区室（phase-separated compartments）内，能够同时接触RNA和DNA，从而产生这种“意外”的直接相互作用。

蛋白质-DNA相互作用模式的汇总

这项研究总结了蛋白质与DNA的四种主要相互作用模式：

球状DNA结合结构域（globular DNA-binding domains）: 蛋白质通过特定的、具有稳定三维结构的区域直接与DNA结合。

DNA结合内在无序区域（DNA-binding IDRs）: 蛋白质通过其灵活的、无序的区域与DNA直接接触。

环境邻近性（circumstantial proximity）: 蛋白质通过与组蛋白（histone-binding proteins）或其他蛋白质（如剪接因子，splicing factors）的相互作用，间接地靠近DNA。

相分离区室（phase-separated compartments）内：

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