科研必备！CRISPR/Cas9 实验流程 protocol 全解析

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3.2 阳性克隆筛选

• 挑取6个单克隆扩大培养
• 菌落PCR验证（引物：载体通用引物）
• Sanger测序确认插入序列正确性

• 使用Precut SgRNA Cloning kit
• Oligo退火：95℃ 5min，每分钟降1℃至25℃
• 连接反应：16℃过夜
• 转化DH5α感受态细胞

sgRNA活性验证
4.1 SSA报告系统

4.2 活性检测

• 转染48h后检测荧光素酶活性
• 设置阳性/阴性对照
• 计算切割效率（≥70%为合格）

• 使用Precut pSG-target Cloning kit
• 构建含靶位点的报告载体
• 共转染Cas9/sgRNA表达质粒

5.基因敲除细胞系建立
5.1 细胞转染
5.2 单克隆筛选
5.3 基因型鉴定
5.4 细胞系保存

• 扩大培养阳性克隆
• 液氮冻存备用
• 建立细胞系档案（包括基因型信息）

• 提取单克隆基因组DNA
• PCR扩增靶区域（2%琼脂糖凝胶电泳）
• TA克隆测序分析突变类型
• 筛选双等位基因突变克隆

• 有限稀释法接种96孔板
• 根据预测效率调整接种密度
• 荧光显微镜定期观察

• 优化转染条件（脂质体法/电转法）
• 使用带荧光标记的质粒监控转染效率
• Neo抗性筛选（G418，2周）

注意事项：

1. 实验全程需设立阴性对照
2. 建议使用CRISPResso等软件分析测序结果
3. 定期检测细胞系基因型稳定性
4. 严格遵守生物安全规范操作

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