主要观点总结
CRISPR-TO技术是一种可编程的转录组空间组织技术，能够精准、可逆地控制细胞内源性RNA的定位。该技术通过核酸酶失活的Cas13（dCas13）引导RNA到达特定的亚细胞区室，实现RNA在活细胞中的精准操控。CRISPR-TO技术可应用于多种亚细胞区室，包括线粒体外膜、P-小体、应激颗粒等，并且具有可诱导性和可逆性。在神经元中的应用更是突破了传统方法的局限。这项技术的出现为空间转录组学领域带来了革命性的突破，有望为我们深入理解RNA在生命活动中的功能提供宝贵的见解。
关键观点总结
关键观点1: CRISPR-TO技术的核心原理
CRISPR-TO技术利用核酸酶失活的Cas13（dCas13）通过引导RNA到达特定的亚细胞区室，实现RNA在活细胞中的精准操控。该技术具有可编程性，可通过改变gRNA序列来靶向不同的RNA。
关键观点2: CRISPR-TO技术的应用范围
CRISPR-TO技术可应用于多种亚细胞区室，包括线粒体外膜、P-小体、应激颗粒、端粒、核应激体以及微管正负端等。此外，该技术还适用于原代细胞，特别是在神经元等复杂原代细胞中的高效应用。
关键观点3: CRISPR-TO技术的优势
CRISPR-TO技术具有多种优势，包括无需基因组改造、多功能定位、精准时空控制等。此外，它还具有高通量筛选潜力，可通过改变gRNA序列来大规模筛选不同RNA的功能。
关键观点4: CRISPR-TO技术在神经元中的应用
CRISPR-TO技术在神经元中的应用展示了其巨大的潜力。通过精准操控内源性RNA的定位，该技术可以影响神经元的形态和功能，包括促进轴突生长、调节神经元再生等。
关键观点5: CRISPR-TO技术的未来展望
随着技术的发展，CRISPR-TO技术有望在未来实现单载体系统、更紧凑的dCas13变体，以及由计算算法优化gRNA效率和特异性。这项技术有望为我们深入理解空间RNA组织在各种细胞类型和疾病背景下的生物学功能提供宝贵的见解。
正文
当脱落酸被添加时，它会促使dCas13与“定位信号”或“分子马达蛋白”结合，从而将dCas13以及它所结合的目标RNA一同引导到预设的亚细胞区室。这项技术支持两种模式的RNA定位：被动扩散和停靠（passive diffusion and docking），以及主动运输（active transport）。
CRISPR-TO的首次亮相，是将报告mRNA（reporter mRNA）精确地定位到细胞的
线粒体外膜（outer mitochondrial membrane, OMM）
上。研究人员设计了靶向GCN4元件的gRNA，并观察到惊人的效果：在ABA处理下，高达74.5%的报告mRNA被成功定位到OMM上，而对照组（DMSO处理或非靶向gRNA）的比例则仅为12.7%和13.9%。表明，CRISPR-TO介导的RNA招募是可诱导且依赖gRNA的。
不仅如此，CRISPR-TO还能精准调控内源性RNA。研究人员将甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）mRNA——一种参与糖酵解和RNA调控的关键基因——定位到OMM。单分子RNA FISH（single-molecule RNA FISH）技术证实了定位的特异性。同样，在靶向gRNA（gT）和ABA处理下，74.5%的GAPDH mRNA成功定位到OMM，远高于对照组的12.7%和13.9%。这展现了CRISPR-TO对内源性RNA的强大操控能力。
该系统还成功将包括β-肌动蛋白（ACTB）mRNA和线粒体氧化磷酸化亚基编码mRNA（SDHC、SDHD和NDUFS2）在内的多种内源性mRNA定位到OMM，即使它们表达水平不同，效果依然显著。此外，CRISPR-TO在不同细胞类型和物种中都表现出良好的通用性，包括人HeLa细胞、人HEK293T细胞和小鼠Neuro-2a神经母细胞瘤细胞。在稳定表达CRISPR-TO组分的HeLa细胞中，OMM定位的GAPDH mRNA比例从0%显著提高到65%，这进一步证明了其在不同传递方法下的灵活性。
在测试不同的Cas13系统时，研究发现dPspCas13b展现出最高的RNA重定位效率，而dRfxCas13d和dLwaCas13a则效果不佳。这提示dCas蛋白的内在特性对CRISPR-TO的效率有显著影响，为未来的优化提供了方向。
揭秘CRISPR-TO的“高效秘籍”：探寻RNA定位的决定因素
CRISPR-TO的高效并非偶然，研究人员深入探究了影响其性能的关键因素：
mRNA表达水平：
研究发现，虽然OMM上dCas13的定位水平在不同mRNA表达水平下保持相对稳定，但OMM上定位的mRNA百分比却与表达水平呈负相关（Spearman相关系数r = -0.73）。这意味着CRISPR-TO在定位中低表达水平的mRNA时效果更佳，但在高表达水平（例如每细胞约1.2 × 10^5个mRNA颗粒）下，仍然能够检测到显著的OMM富集。
dCas13结合位点数量：
为了确定有效RNA定位所需的最小dCas13结合位点数量，研究测试了不同GCN4重复序列数量的报告mRNA。结果显示，三个GCN4重复序列就足以实现50.6%的OMM中位mRNA定位，这表明仅需三个dCas13结合位点即可有效介导RNA组织。
gRNA数量：
单条gRNA即可诱导GAPDH mRNA定位到OMM，但两条或三条gRNA能够显著提高效率。这提示dCas13结合位点对目标mRNA具有多价效应。
gRNA设计原则：
研究人员进一步探索了影响CRISPR-TO性能的gRNA设计因素。通过线性回归和置换特征重要性分析，他们发现读取覆盖度（read coverage）对CRISPR-TO效率具有最强的正向影响（置换均值0.30，系数0.49），而脱靶命中（off-target hits）则表现出最显著的负面效应（置换均值0.23，系数-0.44）。gRNA二级结构的影响相对较小。这提示，选择3'UTR区域中具有中等读取覆盖度并最大程度减少脱靶的gRNA靶点，能够实现更好的CRISPR-TO效率。
值得关注的是，CRISPR-TO对目标RNA的稳定性、分布和翻译影响有限。六种内源性mRNA的折叠变化率均低于20%，这表明CRISPR-TO通过靶向3'UTR对RNA的这些基本属性影响极小。此外，CRISPR-TO的脱靶潜力较低。对不匹配gRNA的检测显示，75%的不匹配gRNA显著降低了RNA重定位效率，表明CRISPR-TO对错配敏感。使用两条gRNA能够进一步增强特异性，因为同时结合两条gRNA的脱靶RNA可能性较低。
CRISPR-TO的通用性远不止OMM。研究人员将其应用范围扩展到六个额外的亚细胞区室，包括：
细胞质P-小体（cytoplasmic p-bodies）：
GAPDH mRNA的富集率达到15.4%，对照组分别为7.0%和4.2%。
应激颗粒（stress granules）：
GAPDH mRNA的富集率高达54.1%，对照组分别为20.2%和20.1%。
核端粒（nuclear telomeres）：
TERRA非编码RNA在端粒上的定位从对照组的23.3%-26.8%提高到40.2%。
核应激体（nuclear stress bodies）：
报告mRNA的定位率达到33.0%，对照组分别为17.9%和10.9%。
这些结果证实了CRISPR-TO能够通过将PYL1与不同的亚细胞定位信号或分子马达蛋白融合，实现对RNA的精准定位。
CRISPR-TO还被用于研究P-小体在mRNA周转中的作用。当将GAPDH mRNA招募到P-小体时，GAPDH mRNA的丰度增加了1.3倍。此外，靶向定位报告mRNA到P-小体显著降低了mRNA衰变常数（从0.041 h^-1降至0.031 h^-1），并增加了mRNA半衰期（从16.9 h增至22.7 h）。这些发现支持了P-小体作为mRNA储存而非降解位点的模型。
除了被动扩散和停靠，CRISPR-TO还实现了沿着微管的主动RNA运输。通过将PYL1连接到小鼠驱动蛋白KIF5B（前向运输，KIF5B，负责将货物运往微管正端）和人驱动蛋白KIFC1（逆向运输，KIFC1，负责将货物运往微管负端），研究人员成功将内源性GAPDH mRNA分别导向微管正端（细胞前沿）或负端（中心体）。统计分析显示，69.0%的转染细胞在细胞前沿积累了GAPDH mRNA，而23.9%的细胞在中心体积累了GAPDH mRNA，均显著高于对照组。
