从细胞系开发到制剂药品：治疗性单抗的制造技术

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完全化学成分明确的培养基并不总是能产生高滴度，因此将不含动物成分的水解物添加到培养基中，以提高细胞密度、活力和生产力。 表 2 显示了细胞培养基组分及其对关键质量属性的影响的详细列表。随着灌流培养物的普及， Kuiper 及其同事开发了一种基于补料分批培养基和补料的灌流培养基衍生方法。虽然可以进行进一步优化，但 CHO 培养物从快速衍生的灌注培养基中获得了高生产率和产品质量。除了细胞培养营养物质外，已经表明控制增殖和保持高活细胞密度可以导致更高的产品产量。温度、 pH 值或 CO2 水平的变化会极大地影响他们的生产力。正如 Kim 和 Lee 所表明的，即使对于来自同一亲本克隆的两个 CHO 衍生克隆，细胞系也表现出对培养条件和最大抗体浓度的不同反应。

多年来， USP 操作已经具备较高滴度和稳定性，重点已转移到 DSP 作的优化上，特别是提高产量、纯度和降低 mAb 异质性。在 mAb 生产后， DSP 负责将活性药物成分（ API ），也称为原料药或原料药（ DS ））输送到配方和填充（填充和完成）。配制的 DS 被称为药品（ DP ），可以直接给患者服用。

连续制造结合了改进的工艺性能和柔性制造的优势。与批量或混合生产系统相比，连续生物工艺在多个问题上具有许多优势。它不仅可以降低资本投资成本，还可以实现灵活和标准化的制造流程，从而有助于及时满足需求。通过使用连续技术减少分子在生物反应器中的停留时间也带来了质量优势。

趋势导致了一次性用品的使用，其好处是具有较低的资本投资和运营成本、更高的灵活性、改进的生产调度和更高的流程复制。

由于下游加工得到的药品已准备好提供给患者，因此必须采取并遵守预防措施和法规，以实现产品质量、安全性、可追溯性和可重复性。 cGMP 概述了确保生产和测试所需的流程得到明确定义、验证、审查和记录的措施。根据这些定义，确保产品的生产和控制符合其预期用途的质量标准和产品规格的要求。 GMP 指南基于 图 2 中总结的原则。在严格的 GMP 实施和控制下，药品可追溯。偏差和变化可以很容易地被追踪，并可以采取相应的行动，以避免在整个过程中使患者处于危险之中或失去药物疗效。

图2：世界卫生组织的良好生产规范指南

2.提高 mAb 变体的可制造性

在制药和生物技术行业，由于制造性能差，治疗性 mAb 的开发项目可能会延迟。为了避免与蛋白质稳定性、溶解度或对压力敏感相关的任何问题，在过程的早期进行成药性研究。这些实验包括不同温度下的短期稳定性研究、冻融循环、强制降解研究和高样品浓度下的粘度测定。考虑到原料药和药品质量属性会受到制造过程中微小变化的影响，因此所有步骤都可能对材料质量和患者安全至关重要。因此，必须尽量减少和控制药品中抗体变体的水平。

早在翻译中，就可以通过氨基酸的错误掺入在生产细胞系中形成变体，例如在 CHO 细胞中丝氨酸而不是天冬酰胺的插入孔。虽然两者都是具有相似物理性质的中性极性氨基酸，但这会导致产生不同的氨基酸序列，这种现象被发现是由细胞培养基中特定氨基酸的饥饿引起的。尽管如此，大多数变体源自翻译后修饰（ PTM ）或在制造过程中产生。如果药物的改变与稳定性、活性或疗效相关，则被视为关键质量属性（ CQA ）。

因此，在整个过程中充分表征和控制可能影响药品疗效或安全性的 PTM 至关重要。

主要质量修饰在文献中被广泛描述，糖基化变异通常会影响药代动力学、抗原结合和免疫原性。治疗性 IgG 抗体的先验知识和糖工程进展为优化药物的安全性、功能和有效性提供了机会。应用蛋白质工程技术的示例包括氨基酸交换以防止聚集，或避免互补决定区（ CDR ）中的蛋氨酸残基以防止有影响的氧化。 mAb 氧化主要发生在蛋氨酸残基上，通过形成蛋氨酸亚砜而产生更多的极性侧链。此外，可以用谷氨酰胺取代 N 末端残基以减少焦谷氨酸交配时产生的电荷异构体的数量。通过计算机工程和基于结构的理性设计模拟对蛋白质序列修饰的改进，在预测 表 3 单克隆抗体的易聚集区域、稳定性计算和溶解度方面取得了进展。此外，可以通过实验性压力研究（包括温度、 pH 值和蛋白酶孵育）来监测单克隆抗体的热纳米稳定性的改善，以选择对聚集更具抵抗力的分子。当暴露于不同的温度、 pH 值和压力条件下时，单克隆抗体体结构可能会发生变化，导致不需要的产品可能表现出免疫原性增加而功效和活性降低。其他蛋白质工程方法已在其他地方描述。总结了导致异质性药品的常见 mAb 修饰，以及如何解决这些修饰以减少工艺开发过程中的 mAb 变体。

表3：mAb开发过程中常见的修饰。 【描述了修饰引起的异质性类型、其对 mAb的潜在不利影响、其原因以及在DSP操作或通过蛋白质工程技术可能的解决方案。】

为了检测和表征由 PTM 引起的异质性，研究者不断建立灵敏和定量的先进技术。最近的报告显示了低流量无鞘毛细管电泳 - 质谱法的使用。可以使用基于质谱（ MS ）的方法检测微异质性，该方法由高分辨率天然 MS 和靶向聚糖分析，或通过结合多种技术。涉及 4D-LC/MS 方法（蛋白 A 还原 -RPLC- 酶解 -RPLC/MS ）的多维设置允许通过在线肽图分析测定 PTM 水平，包括氧化、脱酰胺和琥珀酰亚胺形成。为了准确检测 mAb 糖基化模式，使用相同的色谱系统开发了 3D-LC/MS 工作流程。这种多维工作流程的实施表明了在制造过程中执行快速可靠的 PTM 监测的潜力。化学修饰（如氧化、脱酰胺和碎裂）会导致电荷异构体，这可能会影响 mAb 的体外和体内行为。通过改变与靶标的结合行为，组织渗透、分布和药物共动力学可能会受损，因此电荷异构体的分析至关重要。 Liuetal. 等人重点介绍了修饰产生的酸性变体，描述了自由流动电泳与

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