Nature Methods | “双剑合璧”！SUM-seq重塑单细胞多组学图谱，引领科研新范式

生物探索 · 公众号 · 生物 · 2025-05-29 16:35

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（Credit: Nature Methods ）

第一步：样本内索引。研究人员首先分离并固定细胞核，然后将它们平均分配到多个样本中。在这一阶段，他们引入了独特的样本索引 (sample indices)。对于染色质可及性分析 (ATAC)，转座酶 (Tn5) 会被预加载上带有条形码的寡核苷酸 (barcoded oligos)，用于标记可及的基因组区域。而对于基因表达分析 (RNA)，带有条形码的寡核苷酸 (barcoded oligo-dT primers) 则通过逆转录 (reverse transcription, RT) 来索引mRNA分子。这意味着，在进入微流控系统之前，每个样本的ATAC和RNA分子就已经被打上了样本专属的“身份证”。

第二步：液滴内索引。接下来，所有经过第一步标记的样本被混合并加载到微流控系统中，例如10x Chromium平台。在这个系统中，细胞核被封装在微小油滴 (droplets) 中，每个油滴内通常包含多个细胞核。在油滴内部，系统会引入第二层条形码 (droplet barcode)，对油滴内的所有分子进行再标记。这种双重条形码标记策略 (dual barcoding) 确保了即使同一个油滴中含有多个细胞核，也能将测序读段精确地分配回其原始的单个细胞核。

SUM-seq的计算分析流程也同样高效。它使用自主开发的Snakemake分析管线 (Snakemake pipeline)，能够可扩展且可重复地将测序读段分配给相应的样本索引，并通过液滴条形码进行单细胞级别的解复用。最终，生成基因表达矩阵 (gene expression matrix) 和染色质可及性矩阵 (tile matrix)，并根据共享的样本索引和液滴条形码组合来匹配两种模态的数据。

那么，SUM-seq的性能究竟如何呢？

在评估和优化数据质量的实验中，研究人员将人类白血病细胞 (K562) 和小鼠成纤维细胞 (NIH-3T3) 以等比例混合，并使用了16个样本索引进行SUM-seq分析。

高通量与高回收率：实验成功地从10万个双条形码细胞核中恢复了6,215个人类细胞和7,607个小鼠细胞的双模态数据，总回收率高达70%，这意味着与标准工作流程相比，通量提高了约7倍。

极低的碰撞率：关键的是，人类和小鼠的读段分离良好，唯一分子标识符 (UMI) 碰撞率仅为0.1%，ATAC片段碰撞率为3.8%，这表明SUM-seq能够非常有效地区分不同细胞的来源，保证了数据纯度。

媲美甚至超越现有技术：在性能指标上，SUM-seq的单细胞RNA (UMIs和每细胞基因数) 和单细胞ATAC (每细胞峰区片段数、转录起始位点 (TSS) 富集分数、片段大小分布) 模态数据质量持续保持高水平。与目前其他超高通量单细胞RNA测序、单细胞ATAC测序和多组学方法相比，SUM-seq在文库复杂性指标（每细胞基因数和峰区片段数）方面表现出色。例如，SUM-seq的平均基因数可达2,058个，平均片段数可达5,164个，远超其他高通量方法。例如，另一款流行的单细胞ATAC测序技术，dsciATAC-seq，其K562细胞的平均片段数仅为198个，基因数仅为355个。尽管10x Multiome的平均基因数可达2,515个，平均片段数可达9,258个，看似略高于SUM-seq，但其每细胞成本高达0.35欧元；而SUM-seq的每细胞成本低于0.05欧元，显著降低了研究成本，使得百万细胞级别的大规模研究成为可能。

固定和冷冻样本兼容：值得一提的是，研究发现，甘油基冷冻保存 (glycerol-based cryopreservation) 在甘油醛固定 (glyoxal fixation) 后对测序性能指标影响最小，这使得SUM-seq非常适合需要长时间样本收集（如时间序列实验）或大规模细胞图谱项目的异步采样。

这些数据证明，SUM-seq以其卓越的通量、多重分析能力和成本效益，为单细胞多组学研究带来了革命性的突破。

免疫细胞的“变脸”：SUM-seq如何追踪巨噬细胞极化之旅

巨噬细胞 (macrophages) 是先天免疫系统的核心细胞，它们根据微环境信号，能够极化为促炎性的M1状态或抗炎性的M2状态。M1和M2状态在炎症、感染和组织修复中发挥着截然不同的作用。虽然M1和M2极化的关键转录因子已被鉴定，但驱动巨噬细胞极化随时间变化的复杂调控网络仍不完全清楚。SUM-seq的强大功能，使其成为追踪这一复杂生物学过程的理想工具。

研究人员利用SUM-seq分析了人诱导多能干细胞 (human induced pluripotent stem, hiPS) 分化的巨噬细胞，在无刺激的M0状态，以及经脂多糖 (LPS) 和IFN-γ刺激（M1极化）和IL-4刺激（M2极化）后的时间序列中的基因表达和转录因子活性。实验在M0、M1和M2极化的0小时、1小时、6小时、10小时和24小时等五个时间点进行了样本收集，总计18个样本。

高质量数据：研究人员成功地从一个10x Chromium通道加载了15万个细胞核，获得了51,750个通过质控 (quality control, QC) 过滤的细胞核多组学数据，这些数据在各个样本中分布均匀。平均每个细胞核拥有11,900个独特的ATAC片段，TSS分数达到8，40%的片段位于峰区。在RNA数据中，平均每个细胞核检测到407个UMI和342个基因。尽管在RNA模态中，由于技术原因省略了PEG，导致UMI和基因计数相对较低，但高质量、大数量的细胞核样本依然支撑了有效的下游分析。

清晰的细胞状态分离： UMAP 可视化清晰地揭示了M1和M2极化轨迹上细胞的有效分离，并显示出M1和M2特异性标记基因的表达，印证了实验设置的有效性。

多组学因子分析 (MOFA) 揭示极化关键因子：为了深入剖析影响巨噬细胞M1/M2极化基因表达和染色质可及性的关键特征，研究人员进行了多组学因子分析 (MOFA)。结果令人振奋：

M1极化：早期响应因子 (Factor 4) 富集了IFN-γ信号和细胞因子信号通路。持续响应因子 (Factor 1) 则与IFN信号、通用免疫系统过程、IL-1信号和代谢相关。晚期响应因子 (Factor 7) 主要与抗原 (cross-) 呈递和RHO信号相关。