Nature | 戴俊彪/唐鸿志团队搭建高效底盘构建体系，实现复合难降解有机污染物的生物修复

tfoX 基因强化：将来自霍乱弧菌的自然转化调控基因 tfoX 整合到Vmax的染色体上，构建菌株VCOD-2。测试表明VCOD-2可高效整合外源DNA片段（即使低至0.5ng）到细菌基因组，转化效率可提升数倍。同时，线性DNA片段（> 1kb）的转化效率可提升3-5倍，且无抗性标记残留，降低了抗性基因随水平基因转移发生环境泄露的生物风险，减少了工程菌株改造中对抗性标记的依赖性。

图3 调控基因 tfoX 整合位点及线性DNA片段的转化效率

插入位点选择：研究者在Vmax 染色体上鉴定了12个中性基因组位点，作为候选基因簇的插入位点。其中，chr2_297位点表现出最优的基因整合特性，可稳定整合长度达43kb的合成基因簇，且整合过程未对宿主菌的正常生长造成显著影响，为后续多基因簇的高效串联整合提供了理想的基因组平台。

图4 基因组插入候选位点及最优基因整合位点测试

基因簇设计：人工挖掘并设计了多条化合物降解基因簇，通过基因合成与组装技术，构建了VCOD-3至VCOD-11系列包含单条降解基因簇的工程菌株并完成了降解功能测试。选择了针对联苯（ bphA ₁₂₃₄ BCDHIJK ）、苯酚（ dmpLMNOP ）、萘（ nahA _abcd BCDEF ）、二苯并呋喃（ dbfA ₁₂₃₄ BC ）、甲苯（ xylMNABC ）的降解基因簇为候选，并确保其在需钠弧菌中的高效表达。

图5  VCOD-3至VCOD-11系列单降解基因簇工程菌株及降解功能测试

迭代自然转化法（INTIMATE）：针对传统单次转化难以整合大片段基因簇的问题，利用酵母体内组装技术，实现了多个降解基因簇（覆盖单环到多环、杂环有机污染物）的构建。进而利用同源替换策略，迭代整合5个功能基因簇（总长度 43kb）到细菌基因组，构建了多功能菌株VCOD-15。

图6 迭代自然转化法（INTIMATE）示意图