Nature Biotechnology | 效率飙升145倍！新型A-G碱基编辑器精准“修正”线粒...

生物探索 · 公众号 · 生物 · 2025-06-11 16:35

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然而，理想很丰满，现实却很骨感。早期的mtABEs虽然开创了新纪元，但存在一个致命的弱点——编辑效率太低。线粒体疾病有一个关键特征叫做异质性 (heteroplasmy)，即细胞内同时存在野生型和突变型的mtDNA。通常，只有当突变mtDNA的比例超过一个很高的阈值（通常>50%）时，疾病才会表现出来。因此，一个有效的治疗工具，必须能够将突变比例降到足够低，或者在构建疾病模型时，将突变比例提升到足够高。而初代工具那“不温不火”的效率，显然难以担当此重任。

挑战已经明确：我们需要的不是一把普通的“铅笔”，而是一支笔尖锋利、下笔精准、一气呵成的“超级画笔”！这正是该研究的出发点和核心任务。

百炼成钢——在细胞核中打造“超级脱氨酶”

研究团队深知，整个mtABE系统的核心引擎，就是那颗负责执行A到G转换的TadA脱氨酶。要想提升整体性能，必先从强化这个引擎开始。他们采用了一种强大的技术——定向进化 (directed evolution)，对当时性能最优的TadA-8e蛋白进行了一场“魔鬼训练”。

他们首先将战场设定在更容易操作的细胞核 (nucleus)中，构建了一个基于CRISPR的腺嘌呤碱基编辑器（ABE8e）系统作为“训练场”。他们基于TadA-8e蛋白的晶体结构，锁定了16个位于或邻近活性口袋的关键氨基酸 (amino acid)残基，然后对它们进行了系统性的突变，创造出了51个新的TadA变体。

接下来，就是一场残酷的“大逃杀”式的筛选。研究人员在人类HEK293T细胞的两个基因组位点（HEK site 7 和 PTEN-sg2）上，测试了所有这些新变体的编辑能力。这两个位点都包含多个呈“TA*”或“CA*”形式的腺嘌呤（A），这是TadA-8e比较偏爱的编辑模式。

很快，几位“天选之子”在激烈的竞争中脱颖而出。数据显示，原始的ABE8e在HEK site 7的A3位置编辑效率为31.4%，而在A9和A10这两个“非传统”编辑窗口，效率只有8.2%和8.9%。然而，几个新变体表现出了惊人的潜力：

A142W突变体：在A3位置的效率提升至49.7%，而在A9和A10位置，效率分别飙升至32.9%和14.7%！

A142R突变体：同样表现出色，在A3、A9和A10位置的效率分别达到了43.1%、20.9%和12.5%。

L145W突变体：这是一个“广谱高手”，它在A9和A10位置的编辑效率达到了惊人的40.3%和26.0%，相比原始版本提升了数倍之多！

更重要的是，这些新变体不仅提升了效率，还极大地拓宽了编辑窗口和序列偏好性。TadA-8e原本对“YA*”（Y代表C或T）序列情有独钟，而对“RA*”（R代表A或G）序列则“兴致缺缺”。然而，经过对29个内源性基因位点的广泛测试，研究人员发现，这些新变体，特别是A142W和由A142R/L145W组合而成的RW突变体，在所有序列背景下（TA, CA, GA, AA）的活性都得到了显著增强。尤其是在原本最困难的“GA”和“AA”序列上，它们的编辑效率平均提升了4.0到4.5倍！

这意味着，这把“铅笔”的笔尖不仅变得更锋利，而且不再“挑纸”，几乎可以在任何类型的“纸张”（DNA序列）上流畅书写。至此，一个性能超凡的“超级脱氨酶”核心诞生了。现在，是时候把它请出“训练场”，送往它真正的战场——线粒体了。

利刃出鞘——eTd-mtABEs的效率革命

研究人员将这些经过千锤百炼的TadA新变体，与TALE蛋白和线粒体靶向序列（MTS）融合，构建出了一系列全新的线粒体腺嘌呤碱基编辑器，并将其命名为eTd-mtABEs（engineered TadA-derived mitochondrial ABEs）。

它们与前辈，基于原始TadA的sTALED，的对决，结果是压倒性的。

在一个靶向人类mtDNA中ND5基因的位点，sTALED的编辑效率在6.5%到29%之间徘徊。而eTd-mtABE-A142W一出手，效率直接跃升至14%到71%的区间！这意味着在某些碱基位点，效率提升了数倍甚至一个数量级。

在另一个靶向ND1基因的位点，sTALED的表现更差，平均效率仅为7%。而搭载了RW突变体的eTd-mtABE，平均效率达到了26%，如果将编辑器换到另一个TALE臂上，效率更是高达66%！

最令人振奋的数据来自一个靶向ND4基因的位ט点，这里的A-to-G编辑效率最高达到了惊人的87%！这是一个前所未有的数字，它已经远远超过了大多数线粒体疾病发病所需的突变阈值，标志着我们终于拥有了足以在细胞层面高效诱导或逆转线粒体病理状态的强大工具。

研究团队还测试了这些编辑器在大鼠细胞中的表现。结果显示，eTd-mtABEs的编辑效率比传统的TALEDs高出145倍！这种跨物种的超高活性，证明了其强大的普适性和应用潜力。

这场效率革命的意义是深远的。它意味着研究人员在构建线粒体疾病细胞或动物模型时，不再需要“听天由命”，而是可以稳定、高效地引入致病突变，从而更深入地研究疾病机理、筛选药物。对于未来治疗，它也让人们看到了通过一次性编辑，就可能将致病mtDNA比例永久性地压制在安全线以下的曙光。

精准与安全——“脱靶效应”的终极考验

一把威力巨大的武器，如果不能精准控制，就可能造成灾难性的后果。对于基因编辑器而言，最大的风险就是脱靶效应 (off-target effect)——即在非目标位点进行错误的编辑。

研究团队对此进行了极为严苛的“安检”。

DNA脱靶：安全可控