浙大张鹏研究员《自然·通讯》：无需涂层！具有内在免疫相容性的抗异物反应弹性体

高分子科学前沿 · 公众号 · 化学 · 2024-09-02 07:50

正文

可植入生物材料和生物医学器件植入后所引起的异物反应（Foreign Body Response, FBR）会严重阻碍其功能，甚至导致失效。对于弹性体基材来说，开发生物相容性表面涂层是目前广泛接受的抗异物反应方法，但其应用仍面临若干挑战。首先，具有持久抗异物反应性能的材料依然稀缺，有些材料需要复杂的化学合成和纯化过程。其次，复杂的涂层工艺不适合大规模工业生产。第三，不均匀的涂层应用和覆盖不足进一步影响效果。最后，在复杂的生理环境中，涂层脱落的问题也构成重大挑战。克服植入弹性体材料的异物反应，开发具有高度免疫相容性的生物材料仍是一个艰巨的任务。

近期，浙江大学高分子科学与工程学系张鹏研究员开发了一类免疫相容的免涂层弹性体材料，称为EVADE弹性体。EVADE 材料在啮齿动物的皮下模型中有效抑制了炎症和纤维囊形成长达一年，在非人类灵长类动物的皮下模型中达到两个月。与聚二甲基硅氧烷（PDMS）相比，EVADE 材料的植入显著降低了邻近组织中与炎症相关的蛋白质 S100A8/A9 的表达。我们还发现，抑制或敲除 S100A8/A9 可以显著减轻小鼠的纤维化，表明这是一个抑制纤维化反应的新靶点。由 EVADE 弹性体制成的持续皮下胰岛素输注（CSII）导管在耐久性和性能上显著优于商业导管。这里所报告的 EVADE 材料有望通过抵抗局部免疫反应来增强和延长各种医疗设备的功能。这项研究突破了在弹性体表面构建免疫相容性涂层的传统方法，揭示了抵抗纤维化反应的新靶点，为可植入医疗器械的免疫相容性材料提供了全新的选择。该工作以“Immunocompatible elastomer with increased resistance to the foreign body response”为题发表在《Nature Communications》上（Nat. Commun. 2024,15, 7526）。文章第一作者是浙江大学博士生周咸池。该研究得到国家自然科学基金委的支持。

【免疫相容弹性体EVADE的设计】

图1 商用PDMS弹性体与EVADE弹性体的外观与化学结构

EVADE材料基于四氢吡喃醚衍生的甲基丙烯酸酯免疫调节单体HPEMA（图1）。该单体易于合成，并能通过自由基聚合反应实现聚合。为了在聚合物结构中引入物理可交联的部分，我们将HPEMA与丙烯酸十八酯（ODA）共聚。ODA具有长烷基链，可以在共聚物中形成微晶，从而实现物理交联。共聚物通过本体聚合制备，并以HPEMA的摩尔分数命名。例如，由90 mol% HPEMA和10 mol% ODA组成的共聚物被命名为H90。

【免疫相容弹性体的纤维化反应评价】

图2 EVADE弹性体在小鼠皮下植入一个月后所引发的纤维化反应评估

我们选择了三个样品 H50、H70 和 H90 ，进行进一步的体内植入测试，以评估它们的纤维化反应，并与常用医用弹性体 PDMS 进行比较。实验中，我们对 C57BL/6 小鼠进行了皮下植入，每只小鼠的背部植入了所有四个样品。经过一个月的植入期后，我们取出了弹性体片。代表性的照片和组织学图像见图2。组织学染色（包括 Masson 三色染色和苏木精-伊红 (H&E) 染色）显示，EVADE材料（特别是 H90）形成了厚度为 10 至 40 微米的纤维化囊，而 PDMS 植入物的纤维化囊厚度则为 45-135 微米。我们还将 H90 与其他四种常用的生物医用可植入聚合物进行比较，分别是乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物 (EMA)、热塑性聚氨酯（TPU）、聚烯烃弹性体 (POE) 和聚酰胺 (PA)。如图2所示，植入 H90 后几乎未形成任何纤维囊，而其他所有材料均形成了 35 至 160 微米厚的纤维化包膜。这表明 EVADE 材料具有优异的免疫相容性。

【免疫相容弹性体的炎症反应评价】

图3 EVADE弹性体在小鼠皮下植入两周后所引发的炎症反应评估

我们研究了 EVADE 材料在 C57BL/6 小鼠皮下植入两周后引发的急性炎症反应，观察到 H90 仅引起非常微弱的炎症反应。首先，我们通过免疫组织化学切片分析了促炎标志物CCR-7、TNF-α 和 IL-6 以及抗炎标志物 IL-10，以评估弹性体植入对周围组织炎症水平的影响（如图 3a）。结果显示，PDMS 显著增加了弹性体与组织界面处的炎症标志物，而 EVADE 材料的炎症标志物表达明显较低，其中 H90 的表现最为显著（约为 PDMS 弹性体周围组织中观察到的 1/6 到 1/8）。尽管如此，抗炎标志物 IL-10 的表达在 EVADE 和PDMS 弹性体之间没有显著差异。接着，我们提取了植入物周围的细胞，并进行了单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 分析，以检查免疫细胞的组成和基因表达（如图 3b）。通过单细胞转录组的 k 均值聚类分析，我们识别出八种细胞类型中的三个主要簇：巨噬细胞、树突状细胞和 T/自然杀伤细胞。基因分析表明，H90 的植入引发了免疫细胞中炎性细胞因子、趋化因子和集落刺激因子的广泛下调。

【免疫相容弹性体植入后的表面蛋白质组学分析】

图4 皮下植入后24小时，从回收的弹性体表面提取的蛋白质裂解物的蛋白质组学分析

蛋白质吸附是异物反应过程中至关重要的初始步骤，研究植入物植入早期后表面蛋白质的吸附情况，有助于深入了解EVADE材料降低异物反应的机制。我们通过蛋白质组学鉴定了植入后24小时吸附在H90和PDMS表面的蛋白质种类（图4）。结果显示，在24小时内，白蛋白是 PDMS 和H90 材料表面吸附量最大的蛋白质。在 PDMS 表面，炎症相关蛋白 S100A8 和 S100A9 的比例较高，分别为 7.2% 和 13.1%，而在 H90表面的吸附量则显著较低，分别为 3.5% 和 7.4%。这些结果表明，S100A8/A9 蛋白的表达和吸附可能会加剧炎症反应，进而促进体内 FBR 的发生。

【S100A8/S100A9蛋白抑制/基因敲除模型的构建与纤维化反应验证】

图5 S100A9药物抑制模型与S100A8基因敲除模型的构建与纤维化反应评估

尽管大量研究支持 S100A8/A9 蛋白在炎症反应中的作用，但尚无直接证据表明抑制这些蛋白的表达可以减轻植入物的异物反应。基于我们的结果，我们假设抑制 S100A8/A9 表达可能有助于降低植入物的异物反应。为验证这一假设，我们首先测试了S100A9抑制剂 tasquinimod (TAS) 对 PDMS 片的纤维化反应。TAS 是一种口服活性喹啉-3-甲酰胺，具有与组蛋白去乙酰化酶 4 (HDAC4) 和 S100A9 高亲和力的结合。在 PDMS 植入后 30 天内，我们通过每日饮用水向小鼠提供两种剂量的 TAS（1 mg/kg 和 3 mg/kg）（见图 5a-c）。Masson 切片显示，TAS 组 PDMS 周围的胶原沉积明显减少，纤维囊厚度约为未施用 TAS 时观察到的 1/2 至 1/3倍，表明PDMS片的异物反应得到抑制。此外，我们还构建了S100A8 敲除 (KO) 小鼠模型，通过将Floxed-S100A8 转基因 (Tg) 小鼠与LysM-Cre Tg 小鼠杂交（见图 5d-f）。将PDMS 圆盘植入皮下一个月后，组织学结果显示，S100A8 敲除的小鼠中几乎观察不到纤维化囊形成。综上所述，这些发现表明 S100A8/S100A9蛋白在材料植入后的纤维化过程中起着关键作用，降低这些蛋白的表达可以有效减轻材料诱导的异物反应。

【免疫相容弹性体的长期植入与非人灵长类植入模型评价】

图6 小鼠长期植入模型与非人灵长类植入模型验证

生物材料抵抗长期纤维囊形成的能力对维持体内植入装置的功能至关重要。为评估这一点，我们进行了为期一年的植入研究，并在十二个月后取回弹性体样品进行纤维化评估。所有 H90 弹性体样品均显示出清晰的轮廓，并被较薄的纤维囊包围，如数码照片和M&T 染色所示（见图 5a）。相比之下，对照的PDMS 弹性体在植入后形成了厚厚的胶原层，植入十二个月后完全被覆盖。为了将这些发现扩展到更高级的物种，我们在健康的食蟹猴皮下植入了 H90 和 PDMS 弹性体片（见图5b）。两个月后取出植入物并进行分析。Masson 三色染色显示，PDMS 样品中存在显著的纤维化反应（最多 180 μm），而 H90 的胶原层较薄（最多60 μm）。值得注意的是，在两只实验猴中没有观察到纤维化包裹现象。

【免疫相容弹性体在胰岛素输注导管上的概念验证】

图7 EVADE弹性体制成的胰岛素输注导管在糖尿病小鼠体内保持了长期功能

我们进一步开发了由 EVADE 材料制成的输注导管，并在糖尿病小鼠模型中评估了它们在标准泵治疗条件下的性能（见图 7）。EVADE 输注导管被植入小鼠皮下并用粘合剂固定，同时市售的 Silhouette 导管作为对照。为了测试 EVADE 导管在小鼠自然运动下的表现，我们将导管连接到输注管线，并让小鼠携带输注器长达 7 天。随后，将导管连接到胰岛素泵（Medtronic MiniMed 722）以评估在持续胰岛素输注期间的功能。小鼠以 10 μL/h 的速率接受持续基础胰岛素输注，并每次进行 45 μL 的胰岛素推注（见图 6b）。植入后第 7 天，我们通过胰岛素泵进行了推注输注的胰岛素吸收试验。与标准皮下（SC）注射相比，通过 Silhouette 导管输送的胰岛素吸收延迟了 0.5-1 小时，而通过 EVADE 导管输送的胰岛素则表现出与 SC 注射一致的药代动力学特征（见图 7c-e）。因此，EVADE 输注器产生的血糖效应与传统的 SC 胰岛素注射相当，这通过给药后 1 小时的最低血糖水平得以体现。相对而言，Silhouette 输注器表现出明显的药理作用延迟，最低血糖水平比 EVADE 组晚 0.5-1 小时。这些发现凸显了 EVADE 材料通过减少局部免疫反应来改善植入式生物医学设备体内性能的潜力。

【小结】

作者开发出一种免涂层的免疫相容性弹性体，该弹性体易于合成、无毒，植入后炎症可忽略不计，且具有长期抗纤维化作用。弹性体的机械性能可以在很宽的范围内进行调整。其中，性能最优的H90，在啮齿动物和非人灵长类动物中分别抑制纤维化长达一年和两个月。与生物医学应用中常用的其他弹性体相比，H90始终表现出出色的抗纤维化性能。在探索EVADE材料抗纤维化作用的潜在机制时，作者发现它调节植入后引发的先天性和适应性免疫反应。此外，植入后，炎症相关蛋白S100A8/S100A9在EVADE周围组织的表达水平明显低于PDMS。进一步的S100A9抑制和S100A8敲除研究证实，抑制S100A8/S100A9蛋白的表达可有效降低材料植入引起的异物反应。最后，作者通过实际的胰岛素输注导管模型验证了EVADE弹性体在医疗器械中的实际应用。

该工作是该团队近期在免疫相容性材料研究方面的最新进展之一。传统的可植入生物材料和医疗器械在植入后常常引发强烈的异物反应，这会对器械的功能产生极大影响。为应对这一挑战，团队发展了一系列免疫相容材料和表面修饰方法，系统探索了植入材料的化学结构与免疫相容性之间的关系，并揭示了全新的抗纤维化生物靶点。在过去的一年中，团队开发了一系列基于两性离子材料的免疫相容水凝胶材料（Adv. Sci.,2024, 11, 2308077; Biomater. Sci., 2024, 12, 468）、免疫相容弹性体材料（Acta Biomater., 2024, DOI: 10.1016/j.actbio.2024.06.047）以及基于天然白蛋白的免疫相容表面改性方法（Bioact. Mater., 2024, 34, 482）。

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原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-024-52023-z

来源：高分子科学前沿

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