Cell丨姜长涛/乔杰/庞艳莉/郑明华/贾彦兴团队合作发现全新胆汁酸修饰，揭示其生物合成通路与病理生理功能（微信文章未删减版）

肠道微生物与宿主之间互惠共生，密不可分，定植在宿主体内的共生微生物可以通过多种机制影响宿主生理与病理生理功能。其中，胆汁酸是沟通宿主与肠道微生物的关键信使分子【1-3】。人体在肝脏由至少17种不同的酶将胆固醇代谢为胆酸（CA）和鹅去氧胆酸（CDCA）等初级胆汁酸，而初级胆汁酸通过胆汁释放到肠道，经由肠道微生物代谢为脱氧胆酸（DCA）、石胆酸（LCA）等次级胆汁酸。次级胆汁酸可以通过调控法尼醇X受体（FXR）、胆汁酸G蛋白偶联受体5 (TGR5)、维生素D受体 (VDR) 等宿主受体，在宿主糖脂代谢、免疫应答等多个生理与病理生理过程中发挥关键作用【4-8】，因而受到了研究人员的广泛关注。然而，目前肠道微生物对胆汁酸的修饰类型还有待挖掘，不同胆汁酸与疾病调控的分子机制尚不明确。此外，对菌群胆汁酸代谢的生物合成通路解析是理解次级胆汁酸生成机制、开发靶向性调控策略的必经之路，但目前仅有几类次级胆汁酸的合成通路得到解析【9,10】，很难通过常规的组学手段对新型胆汁酸合成通路进行挖掘，如何不基于先验知识发现新型胆汁酸的生物合成通路仍然是一项非常有挑战性的学科问题。

2024年4月22日，北京大学医学部基础医学院/北京大学第三医院医学创新研究院姜长涛教授团队、北京大学第三医院乔杰院士团队、北京大学第三医院庞艳莉团队、温州医科大学附属第一医院郑明华团队以及北京大学医学部药学院贾彦兴团队合作，在Cell杂志在线发表了题为Gut symbionts alleviate MASH through a secondary bile acid biosynthetic pathway的研究论文，构建了基于点击化学富集策略结合非靶向代谢组学方法的次级胆汁酸挖掘体系，发现肠道菌群对胆汁酸的全新修饰类型—3-酰基化修饰，并在菌群、小鼠、人群三个维度系统地检测了7种3-酰基化胆汁酸的丰度及流行率。通过分离培养建构肠道菌株库及大规模筛选，研究团队发现单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）是3-琥珀酰胆酸（3-sucCA）主要产生者。进一步，通过基于活性的蛋白追踪纯化策略，研究团队挖掘出3-sucCA的合成酶——“BAS-suc”。最后，临床队列提示3-sucCA与代谢相关脂肪性肝炎（MASH）进程呈显著的负相关性。研究团队深入解析了3-sucCA对MASH进程的改善作用与分子机制，发现其通过菌群重塑—促进益生菌嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）的生长，改善肠屏障损伤，降低慢性低水平炎症，从而逆转小鼠的MASH进程。

姜长涛教授团队长期致力于代谢性疾病的发病机制与转化医学研究，重点聚焦肠道菌群介导的器官间对话。团队以肠道菌群产生的多种代谢酶为切入点及潜在干预靶点，首创“肠道菌源酶跨物种调控宿主稳态”新理论：提出肠道菌源宿主同工酶新概念，发现其广泛存在且能跨物种调控宿主疾病，揭示菌源DPP4损伤宿主血糖稳态、介导临床降糖药物响应性的分子机制（Science 2023）；揭示吸烟期间尼古丁在肠道的大量蓄积，通过肠AMPK—神经酰胺轴加重MASH的新机制。首次发现降解尼古丁的肠道共生菌，提出肠道共生菌通过新型尼古丁降解酶NicX改善代谢性疾病的新干预策略（Nature 2022）。此外，研究团队积累了大量关于肠道菌源胆汁酸与代谢性疾病的前期工作，揭示了肠道菌群通过多种胆汁酸代谢酶生成GUDCA、GDCA等胆汁酸，介导菌群—器官互作，调控机体代谢与免疫，靶向胆汁酸代谢酶，能够改善代谢性疾病（Nature Microbiology 2024; Cell Metabolism 2021a, b; Nature Medicine 2018, 2019; Journal of Clinical Investigation 2021, 2015），以上发现揭示了肠道菌源胆汁酸等是介导器官间对话的关键介质。

除了广泛研究的传统胆汁酸，是否还有其他未知的新型菌源胆汁酸可以参与到代谢性疾病中的调控作用中？近期科研人员通过反向代谢组等方法发现了胆汁酸的24位羧基修饰【11】。然而，由于粪便成分复杂、胆汁酸质谱响应性较低，基于单纯代谢组学策略的新型胆汁酸挖掘存在一定局限。那么，是否有高效的菌源胆汁酸挖掘体系，既可以富集胆汁酸衍生物，又可以进行快速辨别？除了已经广泛发现的24位羧基修饰的新型菌源胆汁酸外【12-14】，是否存在其他官能团上进行修饰的菌源胆汁酸？因此，开发全新的胆汁酸挖掘体系并研究其生物合成通路及生理作用具有重要意义。

研究团队基于点击化学的原理，建立了一套菌源胆汁酸挖掘体系。该体系包含能发生点击化学反应的带有炔基的胆酸探针以及带有叠氮基的ACER·resim。胆酸探针经过健康志愿者粪便菌群代谢转化后,其衍生物通过点击化学反应以及ACER·resim的富集，得到浓缩胆汁酸衍生物而含有较少无关代谢物的富集液。胆汁酸衍生物的点击化学产物在非靶向代谢组中展现出100.0761的特征峰，因而实现了胆汁酸衍生物的高效富集和灵敏辨别。通过分子网络分析，研究团队发现了一系列包含酰基化的新型菌源胆汁酸，包括：甲酰化、乙酰化、丙酰化、丁酰化、乙醇酰化、丙二酰化、以及琥珀酰化。通过大规模粪便菌群发酵液分离与化学合成比对，研究团队在胆酸所包含的3个可发生酰基化反应的羟基位点（3位、7位、12位）中，确认所有新型菌源胆汁酸的酰基化位置都发生在3位上。最后，研究团队在菌群、小鼠、人群三个维度系统地检测了新型胆汁酸的丰度及流行率，这些酰基化胆汁酸广泛存在，可能存在一定的生理作用。

图1. 菌源胆汁酸挖掘体系与3-酰基化胆汁酸结构

在评估新型胆汁酸的丰度及流行率过程中，3-琥珀酰胆酸（3-sucCA）在健康志愿者粪便样本中表现出了最高的丰度与流行率。为探索3-sucCA的主要肠道菌来源，研究团队收集了3-sucCA丰度最高的健康志愿者的粪便样本，通过分离培养建构肠道菌株库、大规模菌株筛选、小鼠定植检测实验确认了单形拟杆菌在体外或体内都存在3-sucCA合成能力。

生物合成通路的探索是菌源胆汁酸研究领域的重点和难点【10, 15-17】，也是精细调控肠道菌群作用的关键一步。为探索单形拟杆菌中负责3-sucCA生物合成的关键酶，研究团队通过大肠杆菌过表达实验检验了单形拟杆菌中所有的16种注释为酰基转移酶的基因，然而这些候选基因都没有产3-sucCA的活性。接下来，研究团队以单形拟杆菌裂解液粗酶反应为基础，通过基于活性的蛋白纯化与鉴定方法，逐步根据裂解液 > 80%硫酸铵蛋白沉淀 > 疏水相互作用色谱（HIC）> 离子交换色谱（IEC）层层纯化，最终利用蛋白质谱分析发现了共118候选蛋白。团队利用蛋白异源表达实验将以上118个蛋白全部进行一一验证，发现只有当过表达一个被注释为β-内酰胺酶的蛋白A7UYF6时可以使大肠杆菌获得产生3-sucCA的能力。进一步地，研究团队通过基于CRISPR-Cas系统的厌氧菌基因敲除实验、近缘同属菌株过表达实验、以及纯酶体外酶促实验验证了该酶负责3-sucCA的生物合成，并将该酶命名为“BAS-suc”。

研究团队招募了55名经活检的MAFLD病人与21名对照人群队列，通过靶向代谢组检测以评估粪便胆汁酸含量。临床研究发现，粪便中3-sucCA含量随着MAFLD疾病进程逐步降低，且与疾病相关指标（ALT/AST）等呈显著负相关关系。3-sucCA是否参与改善MAFLD疾病进程？通过小鼠实验，研究团队发现3-sucCA可以改善小鼠MASH表型，且其有益作用依赖于肠道菌群的存在。多水平实验发现：3-sucCA可以在体内外都促进嗜黏蛋白阿克曼氏菌的生长。作为新一代益生菌的典范，多项报到提示嗜黏蛋白阿克曼氏菌可以通过缓解肠道屏障损伤改善MALFD等多种代谢性疾病【18, 19】。为了探究3-sucCA是否依赖嗜黏蛋白阿克曼氏菌改善MAFLD疾病进程，研究团队通过开创性地将两种嗜黏蛋白阿克曼氏菌特异性“清除剂”【20】运用到动物实验中，发现嗜黏蛋白阿克曼氏菌清除剂的添加会逆转3-sucCA对MASH的改善作用；Tlr4^-/-小鼠实验也证明3-sucCA以LPS—LTR4通路依赖的方式改善MASH。

3-sucCA如何促进嗜黏蛋白阿克曼氏菌生长？转录组与非靶向代谢组揭示出3-sucCA可以通过促进嗜黏蛋白阿克曼氏菌对葡萄糖的胺化与利用进而加速其细胞壁主要成分—肽聚糖的合成。不同碳源底物利用实验也说明：当氨基糖匮乏，葡萄糖作为唯一碳源情况下，3-sucCA对嗜黏蛋白阿克曼氏菌存在最大的生长加速作用。进一步地，表面等离子共振技术（SPR）揭示出嗜黏蛋白阿克曼氏菌唯一可以实现胺化/脱胺的酶NagB与3-sucCA存在较强的相互作用。由于嗜黏蛋白阿克曼氏菌缺乏高效的遗产操作体系，研究团队在大肠杆菌中通过基因敲除与替换，成功地模拟了嗜黏蛋白阿克曼氏菌苛刻的营养需求，并发现3-sucCA通过NagB实现了对嗜黏蛋白阿克曼氏菌生长的调控作用。

以上结果在临床队列中也得到验证，具体表现为：单形拟杆菌与嗜黏蛋白阿克曼氏菌丰度随着MAFLD疾病进程逐渐下降，并且bas-suc基因丰度与3-sucCA和嗜黏蛋白阿克曼氏菌显著正相关，而与MAFLD疾病指标显著负相关。这些结果揭示了3-sucCA作为新型菌源胆汁酸通过菌群互作改善MAFLD的新范式。

胆汁酸作为“肠肝循环”的重要介质，是宿主与菌群协同代谢的经典范例，也是肠道菌群调控宿主生理活动的关键信使。菌源胆汁酸结构存在多样性，但其种类不清、生理功能不明、合成通路有待挖掘，缺少特异性挖掘体系。本工作构建了一种全新的基于点击化学的菌源胆汁酸挖掘体系，并发现一大类之前未被表征的新型菌源胆汁酸—3-酰基化胆酸，并深入地探索了3-sucCA通过肠道菌群互作对MASH进展的改善作用与分子机制，为未来临床治疗MASH等代谢性疾病的潜在药物开发提供了研究基础；此外，本工作系统解析了3-sucCA的生物合成通路，并发现了一类全新的胆汁酸代谢酶BAS-suc，为菌源胆汁酸的生物合成研究提供了新的方向，同时也为调控疾病的肠道菌源酶挖掘研究提供了新范式。

姜长涛教授、乔杰院士、庞艳莉研究员、郑明华教授与贾彦兴教授为本文的共同通讯作者。北京大学医学部基础医学院博士后聂启兴、博士研究生罗茜、汪锴副研究员、博士后丁勇以及药学院博士研究生贾淑密为本文的共同第一作者。

姜长涛，北京大学长聘教授、博雅特聘教授，基础医学院副院长，免疫学系主任，国家杰出青年科学基金获得者、科学探索奖获得者。从事肠道共生菌与代谢性疾病的研究。首创“肠道菌源酶跨物种调控宿主稳态”新理论：提出菌源宿主同工酶的新概念，揭示菌源DPP4介导临床降糖药物响应性的分子机制，为靶向肠道菌群精准干预疾病开辟了全新方向；发现菌群—宿主互作的关键信使—胆汁酸的全新菌源修饰类型及生物合成通路，是脂肪性肝炎防治的新策略；首次发现了降解尼古丁的肠道共生菌及其在脂肪性肝炎发病中的关键保护作用。近5年在Cell（2024）、Science（2023）、Nature（2022）、Nature Microbiology（2024）、Nature Cardiovascular Research（2023）、Cell Metabolism（2021a, 2021b, 2019）、Nature Medicine（2019）等杂志发表SCI论文二十余篇。现因研究发展需要，诚招聘博士后。受聘者具有良好沟通合作能力和团队精神，具备独立从事科研工作的能力，有良好的英语表达和论文写作能力；博士期间以第一作者或共同第一作者发表过高影响因子SCI论文者优先；具有生物合成、受体、信号转导、免疫、代谢等相关领域的研究背景者优先；已取得或即将取得博士学位，年龄不超过35周岁。

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制版人：十一

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