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生物极客马大程博士专访视频，听马博士讲Cas9变形金刚故事，不容错过！
马大程科研博客摘录
十一长假，进行到了第二天，躺在床上，慵懒的想着一天该如何度过，忽然觉得似乎能一眼望到一天的全部，看似“勤奋”的我，这一天也许会这样度过，牺牲掉假期，当看着别人在朋友圈各种玩耍，躺在床上手机刷屏不知道有多久后，在“辛苦的无奈和似乎在奋斗的满意中”，又急急忙忙的起床，赶往实验室，仿佛眼前又突然多出来了无数个deadline，几点前要处理细胞，几点前要看书，几点前，要提好质粒，一天的脚不沾地似乎就这样开始了。我的眼前出现了无数个“重要且紧急”的事情，我牢记着这一“法则”，就像万物必须遵循牛顿定律一样，坚信这一规律的绝对重要，我的一天就在“重要且紧急”的不同事情之间不停的切换。
入夜，初秋的北京夜晚已经跟冬天一样冰冷，拖着疲惫的身躯回到寝室，仿佛觉得自己干了很多事情，但仿佛又很凌乱的一天。
不禁要问，这么多“重要且紧急”的事情，真的我把事情都办好了吗？
躺在床上，碾转反侧，细细回想这一天“重要且紧急”的事情究竟意味着什么？
为了赶在今天前把转染做好，急急忙忙的提好质粒，似乎质粒的整理是一件“不着急的事情”，把质粒随意往冰箱一丢。
为了赶在取样测序的人员来之前把样品准备好，随意标了1，2，3，4，5的数字就匆匆送了出去。
为了做好所有的转染实验，忽然发现原来的实验设计少了一个样品，为了“重要且紧急”的转染，心理想着以后有的是时间来补记，随手拿来一个管子，配好质粒后就做了转染。
为了。。。。
等到晚上，想着自己一天完成了这么多实验，心里是满满地幸福感，觉得这一天，干了这么多实验，真是厉害。
可是，真的把事情都做好了吗？
真的你干的很出色？
事实的情况是：
过了几天，当你再寻找这一批质粒的时候，似乎无从寻找，满眼尽是凌乱加凌乱。
过了几天，当你分析数据的时候，却怎么也想不起来原来增加的那个样品的内容。
过了几天，查找测序结果的时候，怎么也对不上号。
着急和恐慌中，自己往往会先是陷入一种不耐烦的境地，进而实验的挫败和凌乱会进一步的恶化，开始自己的能力，究竟自己适合不适合做科研？
似乎，我们忘却“重要紧急”的理念，这样开始。
实验上，踏踏实实的记好实验笔记，提好质粒后，整理好，如果赶不上一些deadline，就把实验看似推迟的顺延。
处理完事情后，整理好实验台面，将所需要的东西都摆放整齐，看似做了一些不重要且不紧急的事情，然而却极大的提高了效率。
似乎，这样的事情也不仅仅是在实验中发生，一些做computer science的伙伴们，为了“迅速”的做好一件事情，直接就开始操作，遇到困难后，手足无措，四处打听。殊不知，所有的都在指导手册中，如果当初不着急，先学习指导手册，是不是会好一些？
原来，“重要”和“不重要”，“着急”和“不着急”，本就是一个辩证统一的事情，一些看似不着急且不重要的事情，倘若积累起来，则会极大的阻碍一个人的发展，一些不重要不起眼的小事，其实真正的决定一个人的品质。
庆幸的是，上面所说十一的状态，是以前的我，今年的十一，当更多的踏踏实实的办好这些事情后，自己也变得更加的从容。今年已经是博士第三个年头，似乎现在才越来越明白读博士的含义，phD，不仅仅是知识和学历，更多的是在困境中，不断的砥砺内心，不断的思索，学习如何做一个从容不迫、处变不惊、踏实奋进的人。
少一些“重要且紧急”，其实没有那么多重要，又那么紧急的事情，把一件事情完完整整的做好，好的习惯便开始，相信我，你的实验也会出彩！
土鳖博士如何把Cas9玩出变形金刚的感觉？
一稿难投三波折，砥砺吾心炼坚强！
晚上7点，文章online了，曾经幻想过无数次这一时刻，觉得文章online后应该好好休息一下，去爬爬山看看景，或者去风景区看看人海，至少也得去中关村吃一顿好吃的，可真的online后，似乎觉得这件事情已经过去了很久，一如往常做完实验，赶在食堂关门之前，饱饱的吃上一顿，迎接晚上的实验，走在回去的路上，忽然觉得进到这个校园竟然都三年了，三年前自己穿个拖鞋，背个书包就跑到北京，说要来找实验室，找学校准备保研，这一切仿佛还都在昨天，没想到一眨眼，三年就过去了。
三年足够一个初中生走向高中。
三年足够一个硕士毕业。
三年很长，三年里，我究竟学到了什么？难道所有的奋斗，真的只是为了paper上的一个名字？
下一个三年我该怎么去奋斗？！
今天online的这个工作，持续了接近两年，忽然想从头到尾把整个心路历程记下来。
真正说起这个故事，还是得从三年前那个那个穿拖鞋的我说起，那个时候自己还是大四，刚刚被清华合成与系统生物学中心录取攻博，合成生物学？什么是合成生物学？这个领域究竟是什么样一个情况？既没有做过iGEM（国际遗传学大赛，很多后来在合成生物学领域有所突破的博士，都有着本科iGEM的背景），其实也没有读过几篇文献。
既然都要读博士了，我怎么入手这个领域？
对于一个大四的牛犊来说，也许那个时候，评点一篇CNS的文章就好像如果自己是第一作者分分钟就能做完一样，天不怕地不怕，可能所有新手都有这样一个不切实际的想法，尽快的读完这个领域很多文献。
在川大的望江校区，打印店遍地都是，又都很便宜，自己在pubmed上开始检索起”synthetic biology“，下了不知道多少篇文献，竟然整整打印了四大本，从成都一路读到了北京，我的故事和大多数人一样，也许就前几页读了，后面可能都找不到书了。
是的，虽然我累的满头是汗，把这四大本驼到北京，事实上，自己就是那么好高骛远，也没有读几页。
虽然没有读几页，但是大概还是有了一定的印象，原来合成生物学的很多是生物元件系统的开发，利用不同元件的特性，通过一定合理的设计来实现相应的功能。
其中有一个工作［1］还是稍微有了些印象，讲的是什么样一个故事哪？
这篇文章是合成生物学领域的大牛Pamela Silver发表在Nuclear Acid Research上，
说是，利用一种叫做intein（内含肽）的工具，将另外一种可以定制化结合DNA的蛋白叫做TALE给拆开了，拆开后，这样就可以做多个输入。
之所以对这篇文章看着亲切一些，一来是对内含肽比较熟悉，为什么哪？自己大三时候，突然想学学药学院的课，就选修了一些，其中有一门考试有一个名词解释：intein，看着这个单词，第一次见，跟intron比较像，但是后缀又好像蛋白protein的后缀，自己就没敢写，记了下来，然后回来一查，果然是一种蛋白，可以像intron（内含子）发生自剪切。
正如图中两个绿色的部分，内含肽的N端和C端，其中他们可以跟intron一样，发生自剪切，这样就会将两边的蛋白给连接起来。
另外一个比较熟悉的东西是TALE，这个东西很神奇，第一次接触是大三的时候，全国的生物化学与分子生物学年会在成都开，自己偷偷的进去旁听过，其中颜宁的学生邓东，就在报告他们解析了TALE的结构［3］，TALE蛋白中间是由一串重复性单元组成，其中每一个重复性单元由两个helix组成，在helix中间的两个氨基酸特异性的识别某个特异的碱基对。然后不同的重复单元识别不同的碱基对，这样就可以定制化的特异性识别某个特异的DNA序列，通过定制化特异的DNA序列，人们可以特异的结合到某个基因组到位置，比如打开某一个基因的表达，或者对某个位置进行切割。
Nuclear Acid Research这篇文章主要是讲，利用intein将TALE蛋白人为的进行拆分，拆分后，就可以变成两个蛋白，而这两个蛋白当遇到的时候，就可以自剪切，从而形成完整的整体，这样就可以实现一个“与门”的逻辑运算。
当大四时候，读到这篇文章，也并未觉得自己可以利用，虽然当时候，Cas9已经横空出世，各种不同的生物元件在TALE上被证明有效后，就紧接着被转移到Cas9上来，自然一个非常朴素的想法就是intein估计也可以用来拆分cas9，既然一个很简单的想法，自己为什么要follow这样一个idea哪？
就这样，这篇文章，随着尘封的四大本paper，被我遗忘了。
时间就是这样翻过一天又一天。大约一年后，那个时候，我已经正式入学，有一天组会上，导师谢震老师，突然问我们，如果将Cas9应用在生物遗传病的治疗上，你们觉得障碍是什么？
Off－target问题！蛋白太大，无法放到目前被认为比较安全的腺相关病毒载体中！
“那么你们可以想想办法解决吗？”谢老师说道。
“也许我们可以利用内含肽将cas9拆开，这样就可以放到两个载体里面！”我应声答道，“曾经有一篇silver的文章，就是利用intein将TALE拆开”，我突然想到曾经看到的这篇文章，回答道。
从会议室走回实验室的路上，谢老师突然叫住我，“大程，你也许可以试一试，至少这样就可以通过腺相关病毒递送cas9了！”。
获得导师的首肯后，我开始着手设计，正如silver NAR那篇文章中所说，将intein放在蛋白较为柔和的区域［3］，我选择了713，开始了第一个实验。
那个时候，刚刚入学，构建质粒还不是那么顺手，摇摇晃晃，总算把构建出来的质粒做出来了。非常不熟练的做了次转染，细胞死的差不多了，但是还活着的细胞竟然展现出可以被切割的活性？
难道说我真的做出来了？
第二天和导师汇报工作，谢震老师也非常激动，他勉励我，继续测试不同的位点，是否可以在不同的位置有类似的结果。
紧接着师弟彭曙光加入这个project中来，我们一起测试不同位点的切割结果。
时间过的很快，转眼就要到了春节，整整做了一夜实验的我，终于在回家前做好了不同拆分位点，用于切割，转录激活，转录抑制的相关结果，腊月28，踏上了回家的火车。
事情并不像想象的那么顺利，刚过完春节，忽然看到邮箱里一则pubmed的推送，大名鼎鼎的Zhang Feng，发表了题为：“A Split Cas9 Architecture for Inducible Genome Editing andTranscription Modulation”的工作，这不正是我们想做的吗？
刚刚尝试的我，遇到了第一个打击，其实，这还只是开始。
谢老师勉励我们，既然Zhang Lab采取了直接拆分的方法，还是和我们有所不同，是否可以对两者进行比较？
又过了三个月，我们又完成了相应的比较。除了两段拆分，那么我们是否可以进行三段拆分？
既然我们可以使用intein和直接拆分这两种方法，而且有四个不同的位点，那么是否我们可以一个位点使用intein，另外一个位点直接拆分，这样就可以把cas9拆成三个部分？
除此之外，既然对于拆分cas9，已有报道，那么是否我们可以利用合成生物学工具，使用基因线路进行优化？
几个月前，课题组刚刚在Nature Chemical Biology 上发表关于使用互抑制子基因线路对细胞进行分类的工作。那么，我们是否继承实验室其他人的基础，应用在我们的工作上？
说干就干！
课题组的这份工作是通过感知shRNA信号，控制不同的细胞中表达不同的荧光蛋白。那么是否我们可以控制不同的细胞表达偶联不同效应蛋白结构的C端？
就在我们第二次决定投稿的时候，没想到第二个打击就来了。
Pubmed再一次推送了一篇发表在Nuclear Acid Research上的文章，相继在scientific report也有一个关于使用intein的文章，我们intein的希望了也落空了！！
当晚导师谢震打来电话，安慰我说，“大程，不要灰心！我们可以继续完善交换cas9结构域的工作”
图11 不同的小车比喻不同的cas9，在不同的信号下采取不同的另外一端，实现不同的功能。
Cas9如果未来应用于医疗等应用，对Cas9实现精确的控制是必须的，那么就需要哦实现在特定细胞，表达cas9，甚至于在不同的细胞中表达不同的Cas9！
就好像变形金刚，需要cas9，在不同的环境中，具备处理不同事情的能力！
在连续两次被别人先发表后，终于在今年的春节前进行了第一次投稿！
经过8个月漫长的修改，终于在8月底得到了接受的喜讯！
一稿难投三波折，砥砺吾心炼坚强！
回顾这三年，自己从一个邋遢鬼，变的更加注重细节。
回顾这三年，自己从一个拖延症晚期，变的更加高效。
回顾这三年，自己从急功近利变的更加平静淡然。
回顾这三年，既没有像颜宁施一公的弟子们那样，一年级，二年级甚至本科就可以发CNS那样的成绩，也没有做出多么厉害的工作，只是一步一步的，在艰难中不断的改变那个“乱七八糟”的自己，在失败中始终不放弃前进的希望，不知道自己未来在科学世界走多远，不想去想什么时候是第二篇paper，只想脚踏实地，每天在失望中寻找希望！
