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广东工业大学安太成团队ACS ES&T Water内封面:铜基底胁迫下耐药菌与敏感菌生物膜生长适应成...

环境人Environmentor  · 公众号  ·  · 2025-04-29 12:20

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为了探讨 ASB ( E. coli DH5α )和 ARB E. coli DH5α (CTX)) 在铜 基底 上生物膜形成机制的差异,将其与石英基底(空白组)上的生物膜生长进行了比较。对于给定的细菌( ASB ARB ),铜基质上生长的生物膜通常比对照低 10 2 ~ 10 5 倍(图 1a ),这表明铜基底确实抑制生物膜的生长。在对照组中, ASB 生物膜中的细菌丰度比 ARB 生物膜中的细菌丰度高 10 0.5 ~ 10 1.2 倍(图 1a )。相比之下,在铜胁迫下, ARB 生物膜中的细菌丰度比 ASB 生物膜中的细菌丰度高 10 0.5 ~ 10 1.0 倍(图 1a )。说明铜的毒性胁迫下 ARB 生物膜生长较好,而 ASB 生物膜在空白组生长较好。


1. (a) 生物膜细菌丰度随培养时间的变化图; (b) 生物膜厚度随培养时间的变化图; (c) 空白组 EPS 含量随培养时间的变化图; (d) 铜基质下 EPS 含量随培养时间的变化图


我们进一步的对其生物膜厚度进行了探讨,发现 ARB 生物膜在铜基底毒性胁迫下较厚,而空白对照的 ASB 生物膜较厚(图 1b )。 EPS 含量的变化与细菌丰度的变化一致(图 1c-d )。这些结果进一步证实了 ARB 生物膜与 ASB 生物膜生长的适应性成本是相对的。生物膜染色后,用三维共聚焦激光扫描显微镜对生物膜中的活菌和死菌进行成像(图 2 )。与空白对照组相比,在铜基底上观察到生物膜中更多的死亡细菌细胞(细菌染成红色)。在铜基底上, ASB 生物膜中的细菌细胞比 ARB 生物膜中的细菌细胞死亡更多,与对照组相反。这进一步证实了 ARB 生物膜比 ASB 生物膜更能适应恶劣的环境条件, ASB 生物膜更能适应无胁迫的环境条件。这也验证了上述结论的正确性,进一步说明在铜基底毒性胁迫下, ARGs 是一种抗恶劣环境的增强基因,尽管在空白环境下存在一定的适应性代价。


2. 共聚焦激光扫描显微镜图像显示了铜 基底 和对照组下 ASB 生物膜和 ARB 生物膜的三维成像。绿色和红色分别代表活细胞和死细胞( STYO 9 染色的活细菌在 488 nm 激光线激发下发出绿光, PI 染色的死细菌在 560 nm 激光线激发下发出红光)


ARB 生物膜能更好的适应铜 基底 毒性胁迫

当细菌受到有害的刺激时,它们会产生高水平的高活性分子,如细胞内 ROS ,导致氧化和抗氧化系统之间的不平衡。对于抗氧化系统,当细菌受到氧化应激时,会产生特定的抗氧化酶,包括 SOD CAT GSH-Px 。在本研究中,在铜基底上生长的 ASB 生物膜内细菌胞内 ROS 含量比 ARB 生物膜内细菌高 1.1 ~ 1.2 倍(图 3a ),表明 ARB 更能适应铜基底的毒性胁迫。这些结果也很好的解释了 ARB 生物膜比 ASB 生物膜生长的更好,以及 ARB 生物膜内细菌死亡率更低的根本原因(图 1 2 )。相反,空白对照中, ARB 生物膜内细菌的胞内 ROS 水平比 ASB 生物膜内细菌的高 1.1 ~ 1.3 倍。这也进一步表明,在空白条件下,携带 ARGs 的抗生素耐药质粒会给细菌带来适应性负担,使其暴露于氧化应激。相关抗氧化酶含量变化趋势与细胞内 ROS 含量变化趋势一致,进一步解释了氧化应激水平的变化。这些结果解释了 ARB 生物膜对不同环境表现出不同适应性代价的内在原因。


3. 细胞内 ROSs (a) SOD (b) CAT (c) GSH-Px (d) 活性的相对含量; (e) 空白组和铜 基底 下培养的 E. coli DH5α E. coli DH5α (CTX) 中氧化应激相关靶基因和金属转运蛋白的 Log2 倍变化


为了进一步确认生物膜细菌中的氧化应激,阐明生物膜与铜基底在生物膜形成过程中的相互作用,我们检测了氧化应激相关基因( osmC soxR ompR sodA oxyR yiaA rpoS )和金属转运体相关基因( zupT fieF zinT )的表达。空白对照中, ARB 生物膜中氧化应激相关基因表达上调 0.5 ~ 6.7 倍,高于 ASB 生物膜( -3.8 ~ 4.8 倍变化)(负值为下调)。这些结果表明,在没有环境选择压力的情况下, E. coli DH5α (CTX) 的耐药质粒对生物膜生长造成了负担,使细胞在生物膜生长过程中受到强烈的氧化应激,造成适应性代价,导致生长缓慢。这解释了为什么在空白条件下, ARB 生物膜比 ASB 生物膜具有更高的生长适应代价 ( 1 2) 。高表达的 soxR oxyR 基因编码两种调节氧化应激防御机制的转录激活因子,它们进一步诱导膜修复( yiaA )、 DNA 修复( rpoS )和 SOS 应答( ompR )相关基因的表达。


ARB 生物膜在铜基底胁迫下有更好的适应性,是由 c-di-GMP 激活的信号通路引起的

生物膜的生长与许多因素有关,包括鞭毛运动、群体感应( QS )和 c-di-GMP 信号分子。在生物膜生长 72 h 后,检测鞭毛和运动相关基因( motA glgS bssR )、多糖合成( pgaA pgaB )、 c-di-GMP 信号分子( bhsA bdcA )和 QS sdiA lsrK )的表达。空白对照中, ARB 生物膜中 motA bssR







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