正文
为了探讨
ASB (
E. coli
DH5α
)和
ARB
(
E. coli
DH5α (CTX))
在铜
基底
上生物膜形成机制的差异,将其与石英基底(空白组)上的生物膜生长进行了比较。对于给定的细菌(
ASB
或
ARB
),铜基质上生长的生物膜通常比对照低
10
2
~ 10
5
倍(图
1a
),这表明铜基底确实抑制生物膜的生长。在对照组中,
ASB
生物膜中的细菌丰度比
ARB
生物膜中的细菌丰度高
10
0.5
~ 10
1.2
倍(图
1a
)。相比之下,在铜胁迫下,
ARB
生物膜中的细菌丰度比
ASB
生物膜中的细菌丰度高
10
0.5
~ 10
1.0
倍(图
1a
)。说明铜的毒性胁迫下
ARB
生物膜生长较好,而
ASB
生物膜在空白组生长较好。
图
1.
(a)
生物膜细菌丰度随培养时间的变化图;
(b)
生物膜厚度随培养时间的变化图;
(c)
空白组
EPS
含量随培养时间的变化图;
(d)
铜基质下
EPS
含量随培养时间的变化图
我们进一步的对其生物膜厚度进行了探讨,发现
ARB
生物膜在铜基底毒性胁迫下较厚,而空白对照的
ASB
生物膜较厚(图
1b
)。
EPS
含量的变化与细菌丰度的变化一致(图
1c-d
)。这些结果进一步证实了
ARB
生物膜与
ASB
生物膜生长的适应性成本是相对的。生物膜染色后,用三维共聚焦激光扫描显微镜对生物膜中的活菌和死菌进行成像(图
2
)。与空白对照组相比,在铜基底上观察到生物膜中更多的死亡细菌细胞(细菌染成红色)。在铜基底上,
ASB
生物膜中的细菌细胞比
ARB
生物膜中的细菌细胞死亡更多,与对照组相反。这进一步证实了
ARB
生物膜比
ASB
生物膜更能适应恶劣的环境条件,
ASB
生物膜更能适应无胁迫的环境条件。这也验证了上述结论的正确性,进一步说明在铜基底毒性胁迫下,
ARGs
是一种抗恶劣环境的增强基因,尽管在空白环境下存在一定的适应性代价。
图
2.
共聚焦激光扫描显微镜图像显示了铜
基底
和对照组下
ASB
生物膜和
ARB
生物膜的三维成像。绿色和红色分别代表活细胞和死细胞(
STYO 9
染色的活细菌在
488 nm
激光线激发下发出绿光,
PI
染色的死细菌在
560 nm
激光线激发下发出红光)
ARB
生物膜能更好的适应铜
基底
毒性胁迫
当细菌受到有害的刺激时,它们会产生高水平的高活性分子,如细胞内
ROS
,导致氧化和抗氧化系统之间的不平衡。对于抗氧化系统,当细菌受到氧化应激时,会产生特定的抗氧化酶,包括
SOD
、
CAT
和
GSH-Px
。在本研究中,在铜基底上生长的
ASB
生物膜内细菌胞内
ROS
含量比
ARB
生物膜内细菌高
1.1 ~ 1.2
倍(图
3a
),表明
ARB
更能适应铜基底的毒性胁迫。这些结果也很好的解释了
ARB
生物膜比
ASB
生物膜生长的更好,以及
ARB
生物膜内细菌死亡率更低的根本原因(图
1
和
2
)。相反,空白对照中,
ARB
生物膜内细菌的胞内
ROS
水平比
ASB
生物膜内细菌的高
1.1 ~ 1.3
倍。这也进一步表明,在空白条件下,携带
ARGs
的抗生素耐药质粒会给细菌带来适应性负担,使其暴露于氧化应激。相关抗氧化酶含量变化趋势与细胞内
ROS
含量变化趋势一致,进一步解释了氧化应激水平的变化。这些结果解释了
ARB
生物膜对不同环境表现出不同适应性代价的内在原因。
图
3.
细胞内
ROSs (a)
、
SOD (b)
、
CAT (c)
、
GSH-Px (d)
活性的相对含量;
(e)
空白组和铜
基底
下培养的
E. coli
DH5α
和
E. coli
DH5α (CTX)
中氧化应激相关靶基因和金属转运蛋白的
Log2
倍变化
为了进一步确认生物膜细菌中的氧化应激,阐明生物膜与铜基底在生物膜形成过程中的相互作用,我们检测了氧化应激相关基因(
osmC
、
soxR
、
ompR
、
sodA
、
oxyR
、
yiaA
和
rpoS
)和金属转运体相关基因(
zupT
、
fieF
和
zinT
)的表达。空白对照中,
ARB
生物膜中氧化应激相关基因表达上调
0.5 ~ 6.7
倍,高于
ASB
生物膜(
-3.8 ~ 4.8
倍变化)(负值为下调)。这些结果表明,在没有环境选择压力的情况下,
E. coli
DH5α (CTX)
的耐药质粒对生物膜生长造成了负担,使细胞在生物膜生长过程中受到强烈的氧化应激,造成适应性代价,导致生长缓慢。这解释了为什么在空白条件下,
ARB
生物膜比
ASB
生物膜具有更高的生长适应代价
(
图
1
和
2)
。高表达的
soxR
和
oxyR
基因编码两种调节氧化应激防御机制的转录激活因子,它们进一步诱导膜修复(
yiaA
)、
DNA
修复(
rpoS
)和
SOS
应答(
ompR
)相关基因的表达。
ARB
生物膜在铜基底胁迫下有更好的适应性,是由
c-di-GMP
激活的信号通路引起的
生物膜的生长与许多因素有关,包括鞭毛运动、群体感应(
QS
)和
c-di-GMP
信号分子。在生物膜生长
72 h
后,检测鞭毛和运动相关基因(
motA
、
glgS
和
bssR
)、多糖合成(
pgaA
和
pgaB
)、
c-di-GMP
信号分子(
bhsA
和
bdcA
)和
QS
(
sdiA
和
lsrK
)的表达。空白对照中,
ARB
生物膜中
motA
和
bssR