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为了探讨 ASB ( E. coli DH5α ）和 ARB （ E. coli DH5α (CTX)) 在铜 基底 上生物膜形成机制的差异，将其与石英基底（空白组）上的生物膜生长进行了比较。对于给定的细菌（ ASB 或 ARB ），铜基质上生长的生物膜通常比对照低 10 ² ~ 10 ⁵ 倍（图 1a ），这表明铜基底确实抑制生物膜的生长。在对照组中， ASB 生物膜中的细菌丰度比 ARB 生物膜中的细菌丰度高 10 ^0.5 ~ 10 ^1.2 倍（图 1a ）。相比之下，在铜胁迫下， ARB 生物膜中的细菌丰度比 ASB 生物膜中的细菌丰度高 10 ^0.5 ~ 10 ^1.0 倍（图 1a ）。说明铜的毒性胁迫下 ARB 生物膜生长较好，而 ASB 生物膜在空白组生长较好。

图 1. (a) 生物膜细菌丰度随培养时间的变化图； (b) 生物膜厚度随培养时间的变化图； (c) 空白组 EPS 含量随培养时间的变化图； (d) 铜基质下 EPS 含量随培养时间的变化图

我们进一步的对其生物膜厚度进行了探讨，发现 ARB 生物膜在铜基底毒性胁迫下较厚，而空白对照的 ASB 生物膜较厚（图 1b ）。 EPS 含量的变化与细菌丰度的变化一致（图 1c-d ）。这些结果进一步证实了 ARB 生物膜与 ASB 生物膜生长的适应性成本是相对的。生物膜染色后，用三维共聚焦激光扫描显微镜对生物膜中的活菌和死菌进行成像（图 2 ）。与空白对照组相比，在铜基底上观察到生物膜中更多的死亡细菌细胞（细菌染成红色）。在铜基底上， ASB 生物膜中的细菌细胞比 ARB 生物膜中的细菌细胞死亡更多，与对照组相反。这进一步证实了 ARB 生物膜比 ASB 生物膜更能适应恶劣的环境条件， ASB 生物膜更能适应无胁迫的环境条件。这也验证了上述结论的正确性，进一步说明在铜基底毒性胁迫下， ARGs 是一种抗恶劣环境的增强基因，尽管在空白环境下存在一定的适应性代价。

图 2. 共聚焦激光扫描显微镜图像显示了铜 基底 和对照组下 ASB 生物膜和 ARB 生物膜的三维成像。绿色和红色分别代表活细胞和死细胞（ STYO 9 染色的活细菌在 488 nm 激光线激发下发出绿光， PI 染色的死细菌在 560 nm 激光线激发下发出红光）

ARB 生物膜能更好的适应铜 基底 毒性胁迫

当细菌受到有害的刺激时，它们会产生高水平的高活性分子，如细胞内 ROS ，导致氧化和抗氧化系统之间的不平衡。对于抗氧化系统，当细菌受到氧化应激时，会产生特定的抗氧化酶，包括 SOD 、 CAT 和 GSH-Px 。在本研究中，在铜基底上生长的 ASB 生物膜内细菌胞内 ROS 含量比 ARB 生物膜内细菌高 1.1 ~ 1.2 倍（图 3a ），表明 ARB 更能适应铜基底的毒性胁迫。这些结果也很好的解释了 ARB 生物膜比 ASB 生物膜生长的更好，以及 ARB 生物膜内细菌死亡率更低的根本原因（图 1 和 2 ）。相反，空白对照中， ARB 生物膜内细菌的胞内 ROS 水平比 ASB 生物膜内细菌的高 1.1 ~ 1.3 倍。这也进一步表明，在空白条件下，携带 ARGs 的抗生素耐药质粒会给细菌带来适应性负担，使其暴露于氧化应激。相关抗氧化酶含量变化趋势与细胞内 ROS 含量变化趋势一致，进一步解释了氧化应激水平的变化。这些结果解释了 ARB 生物膜对不同环境表现出不同适应性代价的内在原因。

图 3. 细胞内 ROSs (a) 、 SOD (b) 、 CAT (c) 、 GSH-Px (d) 活性的相对含量； (e) 空白组和铜 基底 下培养的 E. coli DH5α 和 E. coli DH5α (CTX) 中氧化应激相关靶基因和金属转运蛋白的 Log2 倍变化

为了进一步确认生物膜细菌中的氧化应激，阐明生物膜与铜基底在生物膜形成过程中的相互作用，我们检测了氧化应激相关基因（ osmC 、 soxR 、 ompR 、 sodA 、 oxyR 、 yiaA 和 rpoS ）和金属转运体相关基因（ zupT 、 fieF 和 zinT ）的表达。空白对照中， ARB 生物膜中氧化应激相关基因表达上调 0.5 ~ 6.7 倍，高于 ASB 生物膜（ -3.8 ~ 4.8 倍变化）（负值为下调）。这些结果表明，在没有环境选择压力的情况下， E. coli DH5α (CTX) 的耐药质粒对生物膜生长造成了负担，使细胞在生物膜生长过程中受到强烈的氧化应激，造成适应性代价，导致生长缓慢。这解释了为什么在空白条件下， ARB 生物膜比 ASB 生物膜具有更高的生长适应代价 ( 图 1 和 2) 。高表达的 soxR 和 oxyR 基因编码两种调节氧化应激防御机制的转录激活因子，它们进一步诱导膜修复（ yiaA ）、 DNA 修复（ rpoS ）和 SOS 应答（ ompR ）相关基因的表达。

ARB 生物膜在铜基底胁迫下有更好的适应性，是由 c-di-GMP 激活的信号通路引起的

生物膜的生长与许多因素有关，包括鞭毛运动、群体感应（ QS ）和 c-di-GMP 信号分子。在生物膜生长 72 h 后，检测鞭毛和运动相关基因（ motA 、 glgS 和 bssR ）、多糖合成（ pgaA 和 pgaB ）、 c-di-GMP 信号分子（ bhsA 和 bdcA ）和 QS （ sdiA 和 lsrK ）的表达。空白对照中， ARB 生物膜中 motA 和 bssR

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