交联纳米SiO2固定化蜗牛酶的制备表征及转化淫羊藿苷研究

淫羊藿苷、宝藿苷I等异戊烯基黄酮苷均为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim. 中的主要活性成分，具有显著的抗骨质疏松、抗肿瘤等药理作用^[1-8]。本课题组前期研究发现，淫羊藿苷口服后在肠道会被肠道酶、肠道菌水解生成宝藿苷I，从而更好地发挥其药理作用^[9]。由于宝藿苷I在淫羊藿原药材中的含量很低^[10]，很难通过化学分离纯化的方法大量制备，而淫羊藿中与宝藿苷I具有相同母核结构的淫羊藿苷含量却很高，因此可采用体外酶解的方法水解掉淫羊藿苷C-7位葡萄糖基，制备药理活性更强的宝藿苷I。

蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中提取的一种含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等20多种酶的混合酶，具有很强的生物转化能力，目前已经被广泛应用于多种中药活性成分的提取、制备研究^[11-14]。本课题组前期研究也发现，蜗牛酶对淫羊藿苷的水解效率极高，其酶解淫羊藿苷的产物主要包括宝藿苷I、淫羊藿苷元和极少量的中间产物淫羊藿次苷I^[15-18]，通过控制酶的加入量、反应时间等因素，可实现蜗牛酶定向水解淫羊藿苷为单一产物宝藿苷I的目的。虽然蜗牛酶水解具有专一性强、反应条件温和、转化效率高、绿色环保等优点，但游离酶存在酶易失活、不可回收、成本高等缺陷，从而限制了其工业化应用^[19-20]。采用固定化技术将酶固定在壳聚糖^[21]、海藻酸盐^[22]、SiO₂^[23]等固体载体上反复使用，不但能显著提高酶的稳定性，还可实现酶的回收再利用，从而降低生产成本，利于工业化生产。其中，纳米SiO₂具有粒径小、比表面积大、化学稳定性好、机械强度高、表面易于改性、价廉易得等优点，是制备固定化酶的理想载体^[24]。为了提高纳米SiO₂对酶的固定能力，本研究以3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）为硅烷偶联剂对纳米SiO₂表面进行氨基改性，再经戊二醛交联处理，通过共价偶联反应制备交联纳米SiO₂固定化蜗牛酶，并采用透射电子显微镜（TEM）、傅里叶红外光谱仪（FTIR）、元素分析等方法对其理化性质进行表征，同时以淫羊藿苷为底物，考察比较了游离和固定化蜗牛酶的最适酶解条件、酶解动力学参数、重复利用性和热稳定性，证明了交联纳米SiO₂作为蜗牛酶固定化载体的可行性，并通过建立高效、可重复利用的固定化蜗牛酶酶解淫羊藿苷工艺，为宝藿苷I的绿色工业化生产奠定实验基础。

1  仪器与材料

1.1  仪器

Waters Acquity ARC高效液相色谱仪，美国Waters公司；MS205DU十万分之一天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；IS10傅里叶红外光谱仪、FLASH2000元素分析仪、1510 MULTISKAN GO酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；JEM-2100型透射电子显微镜（TEM），日本JEOL公司；96孔培养板，美国Corning公司。

1.2  材料

淫羊藿苷、宝藿苷I对照品，批号分别为20110206、20120222，HPLC测定质量分数均≥98%，供含量测定用，购于上海源叶生物科技有限公司；淫羊藿苷元对照品，批号ZL2016110682，HPLC测定质量分数≥98%，供含量测定用，南京泽朗生物科技有限公司；蜗牛酶，酶活力≥90 U/mg，国药集团化学试剂有限公司；EY-QX1型纳米SiO₂，安徽山河药用辅料股份有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），阿拉丁试剂有限公司；BCA试剂盒，美国Thermo Fisher Scientific公司；甲苯，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；25%戊二醛水溶液，国药集团化学试剂有限公司；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2  方法与结果

2.1  分析测定方法的建立

2.1.1  酶活力测定方法^[25]  以淫羊藿苷为底物，在一定条件下振荡反应1 h后，取适量反应液加入9倍量甲醇终止反应，涡旋离心后，取上清液经HPLC检测，计算酶活力。

HPLC色谱条件：依利特Supersil ODS2色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液（75∶25）；检测波长270 nm；体积流量1.0mL/min；柱温30 ℃，进样量10 μL。理论塔板数：淫羊藿苷为1 293.00、宝藿苷I为3 949.46、淫羊藿苷元为4 835.00。

酶活力单位通常用国际单位U表示，酶活力可定义为在60 ℃、pH 5.0条件下，1 g酶每小时水解消耗淫羊藿苷的物质的量，单位表示为μmol/(h·g)，即U/g。酶解反应的初速度（v）为在酶促反应初始阶段，底物转化量＜5%时，单位时间内淫羊藿苷的消耗量。

酶活回收率＝固定化酶总活力/被固定的游离酶总活力

相对酶活力＝酶活力/最高酶活力，最高酶活力为同组实验中酶活力最高点的值，计为100%

转化率＝(反应初始淫羊藿苷量－反应终止淫羊藿苷量)/反应初始淫羊藿苷量

2.1.2  酶固定量测定方法  以牛血清白蛋白（BSA）为对照品，采用梯度稀释法配制质量浓度分别为   2 000、1 500、1 000、750、500、250、125、25 μg/mL的系列对照品溶液。在固定化酶的制备反应结束后，离心收集上清液，沉淀物用蒸馏水洗涤3次，合并洗涤液与上清液，加水定容至刻度即为样品溶液。精密吸取各稀释质量浓度的BSA对照品溶液和待测样品溶液各25μL，分别加入200 μLBCA工作液，震荡混合30 s后，37 ℃孵育30 min，在562 nm处测定吸光度（A）值。以BSA质量浓度为横坐标（X），A值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得标准曲线回归方程为Y＝0.016 1 X＋0.140 5，R²＝0.998 1，BSA在25～1 500 μg/mL与A值呈良好的线性关系。将待测样品溶液的A值代入方程，计算固定化酶的载酶量和固定率。

载酶量＝被固定的游离酶总量/制备所得固定化酶的总量

固定率＝被固定的游离酶量/固定化过程中投入的总游离酶量

2.2  交联纳米SiO₂固定化蜗牛酶的制备及参数优选

2.2.1  交联纳米SiO₂的制备 将1.5 g纳米SiO₂均匀分散在50 mL溶有50 mmol/L APTES的甲苯中，90 ℃下600r/min搅拌12 h，抽滤分离产物，乙醇洗涤3次后，60 ℃干燥12 h，得氨基化纳米SiO₂1.83 g，产率为91.4%；取氨基化纳米SiO₂0.1 g超声分散在5 mL0.25%的戊二醛水溶液中，室温下600 r/min磁力搅拌1 h，离心收集沉淀物，用蒸馏水洗涤3次后，60 ℃干燥12 h，即得戊二醛交联纳米SiO₂ 0.10 g，产率为89.4%。

2.2.2  蜗牛酶的固定化  将交联纳米SiO₂超声分散在5 mL pH 5.0磷酸盐缓冲溶液中，加入适量蜗牛酶溶解后，室温下600 r/min磁力搅拌一定时间，离心收集沉淀，用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，37 ℃真空干燥12 h，即得交联纳米SiO₂固定化蜗牛酶。固定化过程见图1。

2.2.3  固定化参数优选  按“2.2.2”项下方法制备固定化蜗牛酶，分别考察不同酶载比（1∶3、1∶5、1∶7、1∶9）和固定化时间（2、4、6、8、10 h）对固定化蜗牛酶酶活力的影响，结果不同酶载比时的固定化蜗牛酶酶活力（相对酶活力）分别为（100.00±5.08）%、（75.02±3.90）%、（66.65±3.37）%、（55.62±2.23）%（n＝3）；不同固定化时间的固定化蜗牛酶酶活力（相对酶活力）分别为（57.92±2.85）%、（47.50±2.50）%、（100.00± 4.78）%、（63.65±3.92）%、（48.51±2.41）%       （n＝3）。以相对酶活力为考察指标，在酶投入量固定的条件下，固定化蜗牛酶酶活力随载体投入量的增加呈下降趋势，当酶载比为1∶3时，酶活力最高；而随固定化时间延长，固定化蜗牛酶酶活力呈先上升后下降趋势，在6 h时酶活力最高。因此，制备固定化蜗牛酶的最佳酶载比为1∶3，固定化时间为6 h，按“2.1.1”项下方法测得其酶活力为151.0 U/g，酶活回收率为91.0%。BCA法测得固定化蜗牛酶的载酶量为214.5 mg/g，固定率为81.8%，上述结果表明交联纳米SiO₂不但能高效固定蜗牛酶，还能较好地保持其酶活力。

2.3  交联纳米SiO₂固定化蜗牛酶的表征

2.3.1  TEM表征 取适量超声分散后的样品溶液滴于铜网上，滤纸吸除多余液体，室温下干燥后，立即置于TEM下观察样品的外观形貌，拍照，结果见图2。制备的氨基化纳米SiO₂、交联纳米SiO₂、交联纳米SiO₂固定化蜗牛酶形态均为类球形，粒径约15 nm，呈现一定的团聚现象。

2.3.2 FTIR表征  取适量样品和KBr按一定比例混合均匀，经压片机压制成透明薄片后，在傅里叶红外光谱仪上再进行测试。从图3可以看出氨基化纳米SiO₂、交联纳米SiO₂、交联纳米SiO₂固定化蜗牛酶3个样品在470、805、1 100 cm⁻¹均有明显的吸收峰，此3个峰为纳米SiO₂的特征吸收峰，分别归属于Si-O-Si的弯曲振动、对称伸缩振动和反对称伸缩振动；1 545 cm⁻¹处的吸收峰是N-H的不对称伸缩振动，说明氨基化纳米SiO₂氨基化成功；氨基化纳米SiO₂在1 630 cm⁻¹处的吸收峰是与游离水相关的H-O-H键的弯曲振动吸收峰；交联纳米SiO₂、交联纳米SiO₂固定化蜗牛酶在1 640 cm⁻¹处的吸收峰归属于席夫碱中C=N键的伸缩振动，表明醛基化成功，交联纳米SiO₂固定化蜗牛酶的振动强度强于交联纳米SiO₂，可能是酶分子肽键中C=O伸缩振动在此处的叠加；3个样品在2 930 cm⁻¹处的吸收峰归属于-CH₃、-CH₂的伸缩振动；氨基化纳米SiO₂、交联纳米SiO₂在3 434 cm⁻¹处的吸收峰归属于Si-OH的伸缩振动，但交联纳米SiO₂的振动强度强于氨基化纳米SiO₂，可能与交联纳米SiO₂中席夫碱的N-H伸缩振动在此处的叠加有关，交联纳米SiO₂固定化蜗牛酶在3 413 cm⁻¹的振动强度强于交联纳米SiO₂，可能与酶分子羧基中O-H伸缩振动在此处的叠加有关，结果表明酶被成功地固定在交联纳米SiO₂上。

2.3.3  元素分析 用FLASH2000元素分析仪对氨基化纳米SiO₂、交联纳米SiO₂、交联纳米SiO₂固定化蜗牛酶中的C、H、N元素的含量进行测定，元素分析结果如表1所示。氨基化纳米SiO₂中N元素的含量为1.92%，表明氨基被成功接枝到纳米SiO₂上；交联纳米SiO₂中C元素的含量较氨基化纳米SiO₂明显升高约1.3倍，表明戊二醛交联纳米SiO₂制备成功；而交联纳米SiO₂固定化蜗牛酶中N、C、H元素的含量均明显高于其他2组，与交联纳米SiO₂相比，N元素含量升高0.5倍，C元素含量升高0.3倍，H元素含量升高0.2倍，表明蜗牛酶被成功固定在交联纳米SiO₂载体上。

2.4  固定化蜗牛酶酶解淫羊藿苷的最适条件考察

以游离酶为参照，取适量固定化蜗牛酶和游离蜗牛酶，按“2.1.1”项下方法测定不同pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）、温度（25、37、50、60、70 ℃）、酶与底物质量比（1∶2、1∶1、2∶1、4∶1）条件下固定化和游离蜗牛酶的酶活力，计算相对酶活力，并以淫羊藿苷转化率为指标，考察固定化和游离蜗牛酶的最适酶解时间（1、3、6、12、24 h），结果见表2～5。固定化和游离蜗牛酶的最适pH值均为5.0，最适温度均为60 ℃，最适酶与底物质量比均为1∶2（表2～4），表明固定化过程基本不影响酶的催化活性。由表5可知，游离蜗牛酶在3 h时基本酶解完全淫羊藿苷，酶解产物有2个，主要为宝藿苷I（775.4 μg）和淫羊藿苷元（46.2 μg），随着酶解时间的延长，宝藿苷I的生成量在减少，而淫羊藿苷元的生成量在增加，酶解24 h时，产物组成中宝藿苷I的量减少为486.4 μg，而淫羊藿苷元的量增加为258.3 μg。固定化蜗牛酶在12 h时基本酶解完全淫羊藿苷，酶解产物只有宝藿苷I，酶解24 h时，宝藿苷I的含量高达956.4 μg，表明固定化蜗牛酶可以定向转化淫羊藿苷为宝藿苷I。

2.5  固定化蜗牛酶的酶学性能考察

2.5.1  酶解动力学参数  分别称取适量的固定化蜗牛酶和游离蜗牛酶，水解不同质量浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）的淫羊藿苷，按“2.1.1”项下方法测定酶解反应的初速度v。以底物浓度的倒数（1/[S]）为横坐标，以酶解反应初速度的倒数（1/V）为纵坐标，采用Linewaever-Burk双倒数法作图，根据求导后的米氏方程1/V＝K_m/(V_max[S])＋1/V_max（K_m为米氏常数，[S]为底物浓度，V_max为最大反应速率）计算K_m和V_max。结果见表6，2种酶的1/V和1/[S] 均呈现良好的线性拟合关系，游离蜗牛酶的K_m值明显低于固定化蜗牛酶，表明蜗牛酶经交联纳米SiO₂固定后对底物淫羊藿苷的亲和力有所下降，但最大反应速率相差不大。

2.5.2  热稳定性考察  分别称取适量的固定化蜗牛酶和游离蜗牛酶，在不同的温度（60、70、80、90 ℃）条件下孵育2 h后，按“2.1.1”项下方法测定酶活力，结果见表7。游离和固定化蜗牛酶的相对酶活力均随温度的升高呈下降趋势，在温度达到90℃时，两者的相对酶活力均低于30%，在此过程中固定化蜗牛酶的热稳定性较游离蜗牛酶并未显著提高（P＞0.05）。

2.5.3  重复利用性考察  取适量固定化蜗牛酶与淫羊藿苷按“2.4”项下最适酶解水解条件反应后，离心，洗涤，收集沉淀物加入淫羊藿苷继续反应，重复上述操作5次，按“2.1.1”项下方法测定酶活力，结果见表8，固定化蜗牛酶在重复利用5次后其相对酶活力仍能保持在70%以上，表明固定化蜗牛酶可显著提高蜗牛酶的利用效率，实现淫羊藿苷的高效生物转化。

3  讨论

纳米SiO₂是一种白色无定形粉末，具有特殊的结构层次、良好的机械强度、较大的比表面积和较强的物理化学稳定性，且价廉易得、安全无毒，是制备固定化酶的理想载体。纳米SiO₂表面存在大量活性硅羟基，可与含有特定官能团（氨基、巯基、环氧基、乙烯基等）的硅烷偶联剂反应，从而实现纳米SiO₂的表面功能化^[26]。本实验先以APTES为硅烷偶联剂对纳米SiO₂表面进行氨基改性，再以戊二醛为交联剂，在温和的反应条件下，使其先与氨基化纳米SiO₂表面的氨基发生Schiff碱反应形成交联纳米SiO₂并引入醛基；交联纳米SiO₂上的醛基再与蜗牛酶分子上的氨基发生Schiff碱反应，从而使蜗牛酶以共价结合的方式牢固地固定在交联纳米SiO₂上^[27-28]。本课题组在前期研究中，以天然高分子材料海藻酸盐作为酶固定化载体，制备了尺寸大小不同的海藻酸钡球/微球固定化蜗牛酶^[18,25]，并将其成功应用于淫羊藿黄酮的生物转化，但由于海藻酸盐凝胶本身机械强度较差，在重复利用的过程中容易吸水膨胀甚至破裂，继而导致酶的泄露，影响其重复利用。而本研究制备的交联纳米SiO₂固定化酶具有较好的机械强度，重复利用多次后依然保持原有形态和性能，总体酶解效率更高。此外，与利用物理吸附作用制备的固定化酶相比，采用共价结合法制备的交联纳米SiO₂固定化酶更稳定，酶不易泄露，且能较好地保持其催化活性。

蜗牛酶经交联纳米SiO₂固定后，酶活回收率达到91.0%，虽然较游离酶有所下降，但依然保持了较高的酶活力，说明固定化过程基本不影响酶的构象和活性中心。与游离蜗牛酶相比，固定化蜗牛酶的最适反应pH值、温度、酶与底物质量比均保持不变，但完全水解等量淫羊藿苷需要的时间变长（12 h），这可能与固定化酶与底物的亲和力较小有关（K_m较大），导致酶解速率变慢，但其酶解产物单一，更有利于获取活性更强、吸收更好、纯度更高的宝藿苷I，而游离蜗牛酶的酶解产物较为复杂，包括宝藿苷I和淫羊藿苷元，且随酶解时间的延长，淫羊藿苷元的生成量在增加，而宝藿苷I的生成量在减少，这可能与游离蜗牛酶与底物的亲和力较大有关（K_m较小），酶解过程中生成的宝藿苷I又进一步被快速水解为淫羊藿苷元，因此游离蜗牛酶水解淫羊藿苷难以获取高纯度的宝藿苷I。固定化蜗牛酶的热稳定性较游离蜗牛酶没有明显提高，推测原因可能是蜗牛酶本身具有较好的耐热性能，所以经固定化后热稳定性提升不明显。固定化蜗牛酶可通过离心、滤过等方法与产物分离，且重复利用5次后，残余酶活力依然保持在70%以上，大大提高了蜗牛酶的利用效率，在一定程度上降低生产成本，利于工业化生产，同时也为固定化酶在中医药领域的应用奠定了实验基础。