网页工具 | 综合计算分析确定了在癌细胞和T细胞中具有双重作用的治疗靶点

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此外，TNFAIP3缺失后，与细胞间相互作用、基质金属蛋白酶和细胞粘附相关的通路也被激活（图3H）。

为了推断介导这些观察到的TNFAIP3缺失引起的差异基因表达的转录因子（TFs），我们应用了LISA通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据和DNA结合基序来识别调控转录因子。

LISA分析暗示RELA、HES2、NR3C1、CEBPB、STAT、FOX和AP-1家族的转录因子作为潜在调节因子（图3I）。

先前的研究表明，RELA、AP-1和CEBPB在介导对TNF刺激的免疫信号分子表达方面起重要作用。

基序富集分析进一步强化了FOX和AP-1家族的作用（图S2G和S2H）。

这些发现共同表明，TNF诱导的NF-κB通路激活在癌症细胞中TNFAIP3失活后的免疫反应中起协调作用。

Para_03

1. 在RNA测序分析中，TNFAIP3基因敲除后TNF诱导的NF-κB信号通路被激活（图3F-3H），表明TNFAIP3基因敲除后增强的CTL介导的细胞毒性是由TNF介导的。
2. 这一假设通过用TNF处理LLC细胞进行了测试，并以IFN-γ作为比较对照。
3. 值得注意的是，用TNF处理后TNFAIP3缺失的细胞被耗尽（图3J和S2I）。
4. 进一步通过使用抗RIPK1抗体进行共免疫沉淀（coIP）分析TNF处理后的LLC细胞中凋亡信号复合物的招募情况，结果显示TNFAIP3缺失细胞中的凋亡复合物中caspase-8和FADD的含量增加（图S2J）。
5. 对IFN-γ处理组的分析显示，TNFAIP3缺失癌细胞和对照编辑的癌细胞之间STAT1在酪氨酸701位点上的磷酸化没有差异（图S2K）。
6. 为了进一步验证TNF对于使TNFAIP3缺失的癌细胞对CTL介导的细胞毒性敏感是必需的，将TNFAIP3缺失引入到TNF受体缺失（Tnfrsf1a-null）的LLC细胞中。
7. 与CD8+ T细胞共培养实验显示，TNF受体的缺失消除了在TNFAIP3缺失的癌细胞中观察到的增强的对细胞毒性的敏感性（图3K），从而证实了在TNFAIP3缺失后观察到的增强的CTL介导的细胞毒性主要是由TNF诱导的凋亡引起的。

Para_04

1. 为了研究Tnfaip3在免疫选择压力下调节肿瘤生长的作用，我们在野生型（WT）B6小鼠体内接种了Tnfaip3缺失细胞和对照编辑的LLC细胞（图S2L）。
2. 与对照编辑的细胞相比，源自Tnfaip3缺失细胞的肿瘤表现出生长速率降低（图3L）。
3. 对肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的检查显示，Tnfaip3缺失肿瘤中的免疫细胞浸润显著增加，包括总CD45+免疫细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞水平更高（图3M）。
4. 该实验使用MC38结肠癌模型进行了重复，在该模型中，Tnfaip3失活同样导致肿瘤进展延迟和肿瘤微环境（TME）中TILs增加（图3N和3O）。
5. 综合这些数据表明，Tnfaip3的消除促进了体内增强的免疫监视。
6. 进一步评估了Tnfaip3缺失对肿瘤对ICB治疗反应的影响。
7. 具体而言，将对照编辑或Tnfaip3缺失的LLC细胞移植到野生型B6小鼠体内，然后用同种型对照或抗PD-1抗体进行治疗（图S2M）。
8. 值得注意的是，仅Tnfaip3的消除就抑制了肿瘤生长，其程度类似于Tnfaip3野生型肿瘤中的ICB治疗（图3P）。
9. 此外，与对照编辑的肿瘤相比，Tnfaip3缺失肿瘤对抗PD-1疗法的反应更为有利（图3P）。

Ablation of TNIP1 in theTNFAIP3-TNIP1 complex facilitates T cell-mediated immunosurveillance

TNIP1在TNFAIP3-TNIP1复合体中的消融促进了T细胞介导的免疫监视

Para_01

1. 在综合分析中，TNFAIP3 相互作用蛋白 1 (TNIP1) 被确定为具有双重角色的重要靶点，既涉及癌症又涉及 T 细胞（图 2H 和 2J）。
2. TNIP1 通过多泛素链与免疫细胞和癌细胞中的 TNFAIP3 相互作用。
3. 值得注意的是，对癌症基因组图谱 (TCGA) 数据集的分析显示，TNIP1 在各种癌症类型中的表达模式与 TNFAIP3 非常相似（图 4A）。
4. 此外，在 1,208 个人类癌细胞系的癌症细胞系百科全书 (CCLE) 中观察到 TNIP1 和 TNFAIP3 表达之间存在显著的相关性（图 4B）。
5. 对九个单细胞 RNA 测序数据集的 117,256 个癌细胞的分析进一步揭示了 TNIP1 和 TNFAIP3 表达比率之间存在显著的正相关（图 4C）。
6. 来自两种不同癌症类型的时空转录组学数据显示，TNIP1 和 TNFAIP3 的表达在特定的空间区域共定位（图 4D），并且在不同的空间细胞簇中表现出显著的正相关（图 4E）。 图片说明 ◉ 图4 靶向癌细胞中的TNFAIP3-TNIP1复合体增强抗肿瘤免疫（A）比较所有TCGA癌症类型中肿瘤组织与相邻正常组织之间的TNFAIP3和TNIP1表达，显示TNFAIP3和TNIP1水平的分布模式相似。 ◉ （B）CCLE数据集中TNFAIP3和TNIP1表达水平的相关性。 ◉ （C）跨9个ICRAFT scRNA-seq数据集的癌细胞中TNFAIP3和TNIP1表达百分比的相关性。 ◉ （D）通过Visium空间转录组测序分析的人类乳腺癌和结直肠癌样本组织切片中TNFAIP3和TNIP1表达的空间特征图。 ◉ （E）不同细胞簇之间TNFAIP3和TNIP1转录组表达的空间相关性。 ◉ （F）共聚焦显微镜图像显示LLC细胞内Tnfaip3与Tnip1的细胞内共定位。比例尺代表10 μm。 ◉ （G）LLC细胞内Tnfaip3与Tnip1共定位的定量。 ◉ （H）LLC细胞中Tnip1共免疫沉淀后未经处理或用TNF（10 ng/mL）处理1小时后的western blot分析。 ◉ （I）体外sgCtrl和sgTNIP1癌细胞与原代CD8+ T细胞竞争测定。NY-ESO-1+人癌细胞混合物暴露于针对NY-ESO-1抗原特异性TCR的激活CD8+ T细胞。 ◉ （J）确认不同人细胞系中TNIP1基因敲除效率的western blot分析。 ◉ （K）log2倍变化百分比，显示与针对NY-ESO-1抗原的CD8+ T细胞共同培养后TNIP1-null细胞的比例变化。数据表示为平均值±SEM（K）。∗p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001（A）Wilcoxon检验和（K）单因素方差分析。ns，不显著。在（B）、（C）和（E）中的统计测试是线性回归分析。数据代表至少两次独立实验（K）。

Para_01

1. 共聚焦显微镜检测证实了Tnip1和Tnfaip3之间的细胞内共定位（图4F和4G）。此外，共免疫沉淀实验确认了它们的相互作用，并且这种相互作用在TNF处理后增强（图4H）。构建了多个表达NY-ESO-1的人类癌细胞系（PANC1、SW620和SNU398）且TNIP1缺失。随后，这些细胞系进行了竞争性测定，涉及与NY-ESO-1抗原特异性初级CD8+ T细胞共同培养（图4I）。不同细胞系中TNIP1敲除效率通过western blot分析得到确认（图4J）。将TNIP1缺失的癌细胞与NY-ESO-1抗原特异性T细胞共同培养显示，TNIP1失活使癌细胞对T细胞介导的细胞毒性更加敏感（图4K），这与TNFAIP3缺失观察到的结果相似（图3E）。因此，破坏TNFAIP3-TNIP1复合物降低了癌细胞的免疫逃逸能力。

Ablation of Tnfaip3 in T cells enhances T cell cytotoxicity

Tnfaip3在T细胞中的消融增强了T细胞的细胞毒性

Para_01

1. 我们的分析突显了TNFAIP3在癌症和T细胞中的双重功能（图2G和2H），促使我们详细探讨其在T细胞中的抗肿瘤功能。
2. 来自人类蛋白质图谱的数据94表明，TNFAIP3的表达在激活的T细胞中高于在初始T细胞中（图S3A）。
3. 这一观察结果通过检查人类泛癌CD8+肿瘤浸润淋巴细胞95进一步得到确认（图S3B和S3C），其中在衰竭和效应T细胞中的TNFAIP3表达水平高于初始T细胞（图5A和5B）。
4. 我们还研究了与TNFAIP3表达相关的基因程序在不同T细胞亚群中的情况。
5. 在初始T细胞中，TNFAIP3与参与TCR信号通路的基因呈正相关（MALT1、NR4A2和NR4A3）（图S3D和S3E）。
6. 在效应T细胞中，TNFAIP3的表达显示出与细胞因子-细胞因子受体相互作用通路中的基因呈正相关（CXCR4、CXCR3和TNFRSF9），以及与整合素介导的信号通路中的基因呈负相关（ITGB2和PLEK）（图S3F和S3G）。
7. 有趣的是，衰竭的T细胞显示在与细胞应激反应相关的通路中呈正富集，包括细胞衰老（ZFP36和ZFP36L2）和自噬（ATG2A），同时在核苷酸代谢中呈负富集（AK5和UPP1）（图S3H和S3I）。 图片说明 ◉ 图5. 在CD8+ T细胞中TNFAIP3缺失增强T细胞激活和抗肿瘤反应 (A) 肿瘤浸润的CD8+ T细胞的主要簇群以及TNFAIP3表达的均匀流形近似和投影(UMAP)可视化。Tex，耗竭性T细胞；Teff，效应性T细胞；Tnaive，初始T细胞。 ◉ (B) TNFAIP3在主要CD8+ T细胞簇群中的小提琴图。 ◉ (C) sgCtrl和sgTnfaip3编辑的活化OT-I CD8+ T细胞与MC38或LLC细胞进行体外共培养测定设置。 ◉ (D) 显示OT-I CD8+ T细胞中TNFAIP3缺失水平的蛋白质印迹图。 ◉ (E) 与sgTnfaip3或sgCtrl OT-I CD8+ T细胞共培养后MC38癌细胞存活数量。(F) 与sgTnfaip3或sgCtrl OT-I CD8+ T细胞共培养后LLC癌细胞存活数量。（每组n=3）。 ◉ (G) 经OVA肽（257–264 aa，SIINFEKL）刺激4小时后CD8+ T细胞中效应标记物IFN-γ的流式细胞术定量。左侧为代表性流式细胞术数据，右侧为IFN-γ+ OT-I细胞比例的汇总条形图。 ◉ (H) RNA测序分析显示sgCtrl和sgTnfaip3 OT-I CD8+ T细胞在与OVA肽（257–264 aa，SIINFEKL）脉冲处理的LLC癌细胞共培养4小时后的差异表达基因（每组n=3）。 ◉ (I) sgTnfaip3与sgCtrl OT-I细胞之间差异表达基因的火山图。统计显著性（-log10 FDR）绘制在基因表达对数变化基础上。 ◉ (J) GSEA显示sgTnfaip3与sgCtrl OT-I细胞之间的上调和下调通路。（NES，标准化富集分数）。 ◉ (K) 体内过继性T细胞转移实验设计概述。LLC-OVA癌细胞（1×10^6）皮下植入，编辑后的OT-I CD8+ T细胞（3×10^6）通过尾静脉注射在接种后第9天转移。 ◉ (L) 过继转移sgTnfaip3-1、sgTnfaip3-2或sgCtrl OT-I CD8+ T细胞后的肿瘤生长曲线。（每组n=6）。 ◉ (M) 过继转移sgCtrl或sgTnfaip3 OT-I CD8+ T细胞后LLC肿瘤内浸润的总免疫细胞（CD45+）的流式细胞术分析。 ◉ (N) 过继转移sgCtrl或sgTnfaip3 OT-I CD8+ T细胞后LLC肿瘤内浸润的CD8+ T细胞的流式细胞术分析。（E–G和L–N的数据表示为平均值±标准差）。 ◉ ∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001, 和∗∗∗∗p < 0.0001由Wilcoxon检验（B），双尾t检验（E、F、M和N）以及双向方差分析（G和L）确定。数据代表至少两个独立实验的结果（E–G和L–N）。另见图S3和表S6。

Para_01

1. 为了研究 TNFAIP3 在调节 CD8+ T 细胞抗肿瘤功效中的作用，我们使用逆转录病毒基因编辑技术制备了 Tnfaip3 缺失和对照编辑的 OT-I T 细胞（见 STAR 方法）。
2. 然后，将这些经过工程改造的 OT-I T 细胞与用卵清蛋白 (OVA) 肽（257–264 aa，SIINFEKL）处理过的 MC38 或 LLC 肿瘤细胞共培养 24 小时，以评估它们的细胞毒性（图 5C）。
3. 基因敲除效率通过编辑后 7 天的 western blot 实验得到确认（图 5D）。
4. 细胞毒性分析表明，与对照编辑的 T 细胞相比，Tnfaip3 缺失的 T 细胞对 MC38 和 LLC 肿瘤细胞表现出更高的细胞毒性（图 5E 和 5F）。
5. 此外，在用 OVA 肽（257–264 aa，SIINFEKL）刺激后，与对照编辑的 T 细胞相比，Tnfaip3 缺失的 T 细胞显示出 IFN-γ 表达水平显著增加，IFN-γ 是一个重要的细胞毒性标志物（图 5G）。

Para_02

1. 为了描述 Tnfaip3 基因敲除对 CD8+ T 细胞的影响，我们在未处理的 OT-I T 细胞以及经过 Tnfaip3 敲除或基因间靶向对照敲除的细胞上进行了 RNA 测序，这些细胞在与 LLC 癌细胞共培养后进行分析。
2. 值得注意的是，被癌症细胞刺激的对照编辑的 T 细胞在抗原暴露后表现出预期的 Tnfaip3 表达增加（图 S3J）。
3. 差异表达分析揭示，在 Tnfaip3 缺失的 OT-I T 细胞中，与 NF-κB 通路相关的基因（Nfkb1 和 Nfkb2）、共刺激分子（Tnfrsf4 和 Tnfrsf14）、记忆程序（Batf3）和参与 JAK-STAT 信号传导途径的效应分子（Ifng）显著上调，相对于对照编辑的 OT-I T 细胞（图 5H–5J；表 S6）。
4. 此外，TNF 信号基因（Vcam1 和 Tnfrsf1a）、趋化因子和趋化因子受体（Ccl2、Ccl3、Ccl4、Ccl5、Ccr4、Cxcl1、Cxcl9、Cxcl10 和 Cx3cl1）、免疫信号分子（Ltbr、Cd24a、Cd9 和 Cd6）以及多个关键转录因子（Irf1 和 Stat5a）也有所上调（图 5H–5J；表 S6）。
5. 令人惊讶的是，作为 TCR 信号传导负调节器的基因（Cbl 和 Cblb）以及调节 T 细胞效应分化（Fli1 和 Cd69）的基因下调（图 5H–5J；表 S6）。
6. 利用 LISA84 推断潜在的转录因子来解释 OT-I T 细胞中 Tnfaip3 敲除后观察到的差异基因表达，我们确定了 STAT5A、JUN 和 PRC2 成分（EZH2、EZH1、EED 和 SUZ12）作为潜在的调控因子（图 S3K）。
7. 基序富集分析进一步突出了 JUNB、NFKB2 和 BCL6 作为潜在的调控因子（图 S3L 和 S3M）。
8. PRC2 复合物在介导染色质抑制、指导效应 CD8+ T 细胞终末分化方面发挥作用。
9. 总体而言，这些发现表明 Tnfaip3 失活增强了 CD8+ T 细胞中的效应编程。

Para_03

1. 体内研究通过过继性T细胞转移评估了Tnfaip3缺失对抗肿瘤功效的影响。
2. 将表达OVA的LLC细胞皮下移植到野生型小鼠体内，随后给予编辑后的OT-I T细胞（图5K；参见STAR方法部分）。
3. 输注T细胞后，未观察到显著的自身免疫相关症状，如体重减轻、烦躁或食欲减退。
4. 与接受对照编辑T细胞的小鼠相比，给予Tnfaip3缺失T细胞的小鼠肿瘤生长显著减缓（图5L）。
5. 流式细胞术分析显示，在接受Tnfaip3缺失OT-I T细胞的小鼠中，浸润到肿瘤中的免疫细胞数量增加，包括总体CD45+白细胞和CD8+T细胞群体均有所增加（图5M和5N）。
6. 综上所述，这些结果阐明了在CD8+T细胞中删除Tnfaip3不仅增强了它们的肿瘤杀伤能力，还促进了TILs的维持。

Combined Tnfaip3 deletion in both cancer cells and T cells enhances anti-tumor efficacy through dual effects

在癌细胞和T细胞中同时删除Tnfaip3基因能通过双重效应增强抗肿瘤功效。

Para_01

1. 鉴于单独切除癌细胞和T细胞中的Tnfaip3观察到的抗肿瘤益处，我们接下来研究了同时在这两种细胞类型中删除Tnfaip3可能产生的潜在协同作用。
2. 通过将Tnfaip3切除或对照切除的癌细胞与Tnfaip3编辑或对照编辑的T细胞共同培养，我们发现双重Tnfaip3失活增加了癌细胞对T细胞介导的细胞毒性的作用（图6A和6B）。
3. TNFAIP3-null A549癌细胞和Tnfaip3-null OT-I T细胞之间的比较基因表达分析揭示了协同通路的上调，包括NF-κB信号传导（NFKB2）、II型干扰素信号传导（ISG15和NOS2）以及TNF信号传导（NFKBIA和CX3CL1）（图S4A和S4B），表明抗肿瘤免疫增强。
4. 这种分析还发现了不同的通路调控，其中肝细胞生长因子受体（MET）信号传导（COL1A1和FN1）在T细胞中优先上调但在癌细胞中被抑制（图S4A和S4C）。
5. 相反，染色体组织通路（APC和NBN）和IFNGR1在癌细胞中上调但在T细胞中下调（图S4A和S4D）。
6. 为了探索体内Tnfaip3缺失的双重效应，将Tnfaip3-null或对照编辑的LLC-OVA细胞皮下注射到WT小鼠体内，随后进行Tnfaip3编辑或对照编辑的OT-I T细胞的过继转移（图S4E）。
7. 值得注意的是，无论是在癌细胞还是T细胞中独立删除Tnfaip3都导致肿瘤生长减少，而同时在两种细胞类型中失活则引发了最强的抗肿瘤反应（图6C和6D）。
8. 这一表型得到了流式细胞术分析的支持，该分析显示，在给予Tnfaip3-null T细胞后，携带Tnfaip3-null肿瘤的小鼠中GZMB+ CD8+ T细胞的浸润增加（图6E）。
9. 总体而言，这些数据强调了Tnfaip3作为放大抗肿瘤免疫的双重效应靶点。 图片说明 ◉ 图6。通过双重效应，TNFAIP3在癌细胞和T细胞中的耗竭增强了抗肿瘤免疫反应（A）体外共培养测定设置，将sgCtrl或sgTnfaip3原代OT-I T细胞与预孵育了OVA肽（257-264氨基酸，SIINFEKL）的sgCtrl或sgTnfaip3 MC38细胞共同培养3小时。24小时后使用流式细胞术计数存活的癌细胞数量。（B）sgCtrl或sgTnfaip3编辑后的癌细胞在与sgTnfaip3或sgCtrl编辑后的原代OT-I CD8+ T细胞共培养后的存活数量。每组n=3。（C和D）sgTnfaip3肿瘤和sgTnfaip3原代CD8+ T细胞单独或联合给予sgCtrl作为对照，在野生型C57BL/6小鼠中的肿瘤生长曲线。将sgCtrl或sgTnfaip3 LLC细胞（1×10^6个细胞）皮下注射到8周龄的C57BL/6小鼠体内。编辑后的CD8+ T细胞（3×10^6个）在癌症细胞接种后第9天通过尾静脉注射给药。（每组n=5只小鼠）。（E）流式细胞术分析肿瘤浸润的CD8+ T细胞（左侧）和GZMB+ CD8+ T细胞（右侧），CD45+细胞门控。（F）TCGA癌症类型中TNFAIP3缺失特征水平与分子表型或通路评分之间部分Spearman相关性的热图。（G）TCGA癌症类型中TNFAIP3缺失特征水平与推断的CD8+ T细胞浸润水平之间的部分Spearman相关性热图。（H）三个临床试验队列中治疗前免疫检查点阻断（ICB）治疗的响应者和非响应者之间的TNFAIP3缺失特征水平比较。（I）回归系数和p值的热图。回归系数和p值来自多元逻辑回归模型，评估TNFAIP3缺失特征与免疫治疗反应之间的关联，并将CD8+ T细胞浸润水平作为混杂变量。使用虚拟变量调整队列特异性效应。（J）根据TNFAIP3基因型进行的精心策划的癌症队列的生存分析。使用Kaplan-Meier估计计算log-rank p值以确定统计显著性。（K）森林图显示从Cox比例风险分析得出的癌症预后风险因素的风险比。完整结果见表S9。ns表示不显著， p<0.05， p<0.01， p<0.001，****p<0.0001，通过双向方差分析（B-D）、双样本t检验（E）、Wilcoxon检验（H）、多元逻辑回归（I）和Cox比例风险分析（K）。数据以平均值±标准差表示，并代表至少两个独立实验（B-E）。参见图S4和表S7、S8、S9。

Para_01

1. 接下来，我们探讨了TNFAIP3表达在人类癌症中的临床相关性。
2. 基于TNFAIP3敲除后差异表达基因生成了TNFAIP3-null签名（表S7；见STAR方法）。
3. 对CCLE数据集的RNA-seq数据分析表明，TNFAIP3-null签名与几个关键通路之间存在关联，包括p53通路、抗原加工和呈递以及细胞因子-细胞因子受体相互作用（图S4F）。
4. 然后使用TCGA数据集对该签名进行了评估。
5. 在大多数人类癌症类型中，TNFAIP3-null签名表现出与炎症反应、细胞因子、抗原加工和呈递以及对TNF、IFN-γ和IFN-α的反应之间的正相关（图6F）。
6. 相反，该签名显示与免疫抑制指标，包括癌相关成纤维细胞（CAF）和M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）之间的负相关（图6F）。
7. 进一步使用TCGA数据的相关性分析揭示了TNFAIP3-null签名与CACFD1、BRF1和WFS1等基因之间的负相关（图S4G）。
8. 在蛋白质水平上，观察到与淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（LCK）、PD-L1和脾酪氨酸激酶（SYK）之间的正相关，而与E-钙黏蛋白（CDH1）、雄激素受体（AR）、HER2和AKT之间的负相关（图S4H）。
9. 进一步检查了TNFAIP3-null签名与TCGA批量肿瘤中CD8+ T细胞浸润之间的相关性，结果显示在各种癌症类型中与CD8+ T细胞浸润之间存在稳健的正相关（图6G；见STAR方法）。
10. 我们在ICRAFT多个队列中的分析表明，TNFAIP3-null签名的存在与对ICB疗法的改善响应相关（图6H）。
11. 为了考虑CD8+ T细胞浸润的潜在混杂效应，我们进行了多变量逻辑回归分析，将CD8+ T细胞浸润水平作为混杂变量（见STAR方法）。
12. 这些分析确认，在调整了CD8+ T细胞浸润后，TNFAIP3-null签名与免疫治疗响应之间的关联仍然显著（图6I；见STAR方法）

Para_02

1. 我们使用癌症突变数据评估了TNFAIP3改变的临床意义。
2. 对来自TCGA数据集的24种癌症类型的分析揭示了五种类型的TNFAIP3改变，每种发生频率均低于5%（图S4I）。
3. 大多数这些突变是错义突变，位于如磷酸化、乙酰化和泛素化等翻译后修饰位点（图S4J）。
4. 进一步分析cBioPortal癌症基因组学数据集，在该数据集中我们整理了来自97个队列涵盖31,127名患者的TNFAIP3改变概况（表S8），结果显示与野生型TNFAIP3相比，TNFAIP3改变的患者预后有所改善（图6J）。
5. 使用COSMIC-3D数据库的研究揭示了TNFAIP3脱泛素化结构域中的第127位苯丙氨酸是一个突变热点（图S4K），这对应于单核苷酸多态性rs2230926，已与各种自身免疫性疾病相关联。
6. 基于这一观察结果，我们将分析扩展到包括先前研究中报道的与自身免疫疾病相关的更广泛的基因，假设自身免疫相关基因的改变可能广泛关联癌症预后的改变（表S8；参见STAR方法）。
7. 在我们的整理数据集中，观察到了其中20个基因的改变（表S8）。
8. 使用Cox比例风险回归模型进行生存分析，调整了年龄、性别、种族和癌症类型等关键预后因素，结果显示这些自身免疫疾病相关基因的改变与较低的风险比（HR < 1，p = 0.015）相关（图6K；表S9；参见STAR方法）。
9. 这表明这些改变与癌症患者的预后改善有关。

Para_03

1. 除了目标优先级排序外，ICRAFT 还通过评估候选药物在不同细胞环境中的效果来促进治疗候选药物的降优先级处理。
2. 作为一个使用案例，我们识别了基因靶点，其删除可以提高癌细胞对免疫介导杀伤的敏感性，但会对免疫细胞产生不利影响。
3. 例如，关键的 NF-κB 信号通路成分 RELA 和 RNF31 的缺失增强了癌细胞对 T 细胞介导杀伤的敏感性（图 2B 和 S5A）。
4. 然而，它们的失活也损害了免疫细胞的生存能力。
5. 具体来说，由于抗凋亡基因如 Bcl-xL、c-IAP1 和 c-IAP2 表达减少，RELA 缺失细胞经历了细胞凋亡（图 S5B-S5E）。
6. 同样地，尽管 RNF31 消融增加了癌细胞对 CD8+ T 和 NK 细胞介导杀伤的易感性，但它也在体外和体内对免疫细胞功能产生了不利影响（图 S5F-S5J）。
7. 这些结果强调了 RELA 和 RNF31 在维持免疫细胞中的关键作用，并突显了它们不适合作为治疗靶点。

Discussion

Para_01

1. 在这里，我们介绍了ICRAFT（https://icraft.pku-genomics.org/），一个综合性的网络平台，旨在简化具有免疫调节作用的基因靶点的优先排序。
2. ICRAFT利用与免疫相关的CRISPR筛选数据集来描绘基因扰动与肿瘤-免疫表型之间的联系，并进一步结合单细胞和ICB临床试验中的转录组分析，以阐明基因表达程序及其临床意义。
3. 通过使用ICRAFT，我们识别出多种具有免疫调节作用的基因候选物，其中TNFAIP3被突出为首要目标。
4. 实验验证证实了TNFAIP3在癌细胞和T细胞中的双重功能，这两种功能均导致增强的抗肿瘤免疫力。
5. 除了目标优先排序外，ICRAFT还可以通过评估不同细胞类型中目标删除的效果来帮助降级基因靶点。
6. 例如，一种在癌细胞中增加肿瘤杀伤但在T细胞中引起功能障碍的目标可能不适合治疗。
7. 此外，ICRAFT还能够更深入地探索不太理解的生物过程，如在B细胞或巨噬细胞中具有双重作用的基因靶点。
8. 因此，ICRAFT提供了系统识别肿瘤免疫治疗靶点的资源。
9. 这一资源将随着新的免疫相关CRISPR筛选数据集、scRNA-seq数据以及临床试验的治疗前RNA-seq数据而继续进行维护、管理和更新。

Para_02

1. 利用ICRAFT，我们进行了综合分析，以确定癌症和T细胞中的关键调控基因靶点。
2. 这些分析突出了SOCS1、PTPN2和TNFAIP3作为跨两种细胞类型的显著靶点。
3. SOCS1和PTPN2在调节癌症和T细胞方面具有双重功能是众所周知的。
4. 通过实验和计算分析，我们证实了TNFAIP3的双重作用。
5. 值得注意的是，识别出的一部分基因在癌症和T细胞中具有双重作用，它们参与负向调控炎症和细胞因子信号传导通路。
6. 理论上，这些通路内基因的缺失可能会使负向调控机制失活，从而增强与炎症相关的通路。
7. 临床上，针对那些具有双重效应的基因进行靶向治疗可以通过增强癌细胞对免疫介导的细胞毒性敏感性同时增加免疫激活来协同增强治疗效果。
8. 本研究代表了一次全面的分析，旨在系统地探索具有双重功能的基因靶点，跨越两种不同的细胞类型，从而为未来研究跨越多种细胞类型和表型的多面性基因建立了一个范式。

Para_03

1. TNFAIP3作为NF-κB活性的负调节因子和TNF介导的细胞死亡的功能。
2. NF-κB途径调控抗凋亡基因和生存基因以及炎症途径的表达。
3. Tnfaip3缺失的小鼠胚胎纤维母细胞对TNF诱导的细胞凋亡高度敏感，存活蛋白Bcl-2、c-IAP1和TRAF2的水平与Tnfaip3野生型细胞相当。
4. 这表明TNFAIP3在不依赖于存活蛋白合成的情况下保护细胞免受凋亡。
5. 此外，TNFAIP3缺陷触发了RIPK1激酶依赖性和非依赖性的细胞凋亡。
6. TNFAIP3被招募到肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）信号复合物（复合物I），在那里它稳定线性（M1）泛素网络，防止TNF受体相关死亡结构域（TRADD）或RIPK1从复合物I解离。
7. 一旦解离，TRADD和RIPK1与FADD和caspase-8相互作用形成细胞质凋亡复合物，我们的数据证实了这一点。
8. TNFAIP3还通过去泛素化caspase-8来保护细胞免受凋亡，并通过去泛素化RIPK3来保护细胞免受坏死性凋亡。
9. 我们发现TNFAIP3缺失的细胞产生高水平的炎性因子和趋化因子，如CCL2、CCL20和CXCL2，导致更多的T细胞和单核细胞募集到肿瘤微环境中。
10. TNFAIP3缺失的T细胞中过度的NF-κB激活增强了炎性因子的产生，而TNFAIP3缺失的癌细胞也对TNF介导的杀伤更加敏感。
11. 这进一步促进了体内肿瘤控制的改善。

Para_04

1. 一种针对PTPN2-PTPN1轴的抑制剂可以增强癌症细胞对IFN-γ的敏感性，并促进免疫细胞激活，在ICB耐药癌症的小鼠模型中诱导出强大的抗肿瘤免疫力。
2. PTPN2抑制剂的成功增强了我们探索靶向TNFAIP3治疗策略的兴趣。
3. TNFAIP3的OTU结构域包含几个可成药口袋，为小分子干预提供了机会。
4. 此外，B细胞、树突状细胞和巨噬细胞中的细胞特异性TNFAIP3缺陷表现出不同的自身免疫表型，
5. 这表明靶向TNFAIP3可能引发广泛的免疫激活，并为癌症患者提供临床益处，类似于PTPN2-PTPN1抑制剂所观察到的效果。
6. 除了小分子药物外，创新的靶向策略如RNA干扰（RNAi）和蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）为在治疗干预中靶向TNFAIP3提供了有前景的方法。

Para_05

1. 失调的炎症和细胞因子通路导致自身免疫性疾病。
2. 我们的基因组分析揭示了TNFAIP3改变可以改善癌症预后。
3. 我们提出TNFAIP3介导免疫激活与抑制之间的平衡，某些改变可能诱发自身免疫，但同时可能降低癌症易感性。
4. 自身免疫疾病源于免疫系统异常激活。
5. 虽然自身免疫反应通常对人类健康有害，但它们可能会相反地减轻癌症发展的风险，这一假设需要进一步研究。
6. 此外，需要全面研究来阐明与癌症预后相关的自身免疫遗传变异的关系。
7. 此外，针对与自身免疫相关的基因进行策略性靶向可能代表了一种激活癌症患者免疫系统对抗肿瘤的方法，这一概念需要系统性的探索。

Limitations of the study

研究的局限性

Para_06

1. 这项研究的一个局限性是ICB RNA-seq数据中可能存在批次效应，这些数据是从各种来源收集的。
2. 为了解决这个问题，我们应用了分位数标准化和ComBat，这两种方法已被证明可以减轻转录组学数据集中的批次效应。
3. 然而，我们承认批次效应无法完全消除。
4. 因此，基因表达比较在一个单独的研究内部比在不同研究之间更可靠。
5. 另一个局限性是对TNFAIP3-TNIP1复合物除TNF诱导的细胞凋亡和NF-κB调节之外的更广泛功能的理解还不完全清楚。
6. TNFAIP3-TNIP1复合物的结构细节及其与其他分子的相互作用也仍不清楚，这突显出需要进行全面的生化研究来阐明这些机制。

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