提升可电离脂质递送效率，长尾递送短mRNA，短尾递送长mRNA。

LNP 由可电离脂质 、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质组成。一方面，可电离脂质的电离性允许将 mRNA 货物封装到 LNP 中；另外一方面，可电离脂质的疏水性允许将其整合至 LNP 的脂质核心中。因此，可电离脂质必须在电离性和疏水性之间取得平衡，才能将 mRNA 成功封装到 LNP 中。由于酸性条件，可电离脂质在内体中发生质子化，促使 mRNA 货物释放至细胞质中。可电离脂质结构对于 LNP 递送效率的高低来说是至关重要的。

目前，越来越多的证据表明可电离脂质尾部的结构显着影响 LNP 介导的 mRNA 翻译效率。C12-200 是将 siRNA 递送至肝脏的理想可电离脂质，也被成功用于递送 mRNA。2024 年 3 月 15 号，宾夕法尼亚大学生物工程系 Mike Mitchell Lab 在Journal of Biomedical Materials Research 发表文章：Influence of ionizable lipid tail length on lipid nanoparticle delivery of mRNA of varying length，以可电离脂质 C12-200 为基础，合成了一系列不同尾长的可电离脂质，对这些可电离脂质配制 LNP 的 mRNA 递送效率展开研究，结果发现，可电离脂质的尾长会对于不同长度的 mRNA 递送效率造成显著影响。

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合成不同尾长可电离脂质，制备 LNP

研究者通过聚胺核心和携带不同烷基尾长度的环氧化物之间的反应来合成 9 种不同尾长的可电离脂质文库。按照标准制剂配方（可电离脂质:DOPE:胆固醇：C14-PEG2000 比例为 35:16:46.5:2.5）配制溶解于乙醇中的有机相，将相应的 mRNA 溶解于 PH3 的 10mM 柠檬酸盐缓冲液中，可电离脂质与 mRNA 质量比为为 10:1，采用微流控设备制备 mRNA-LNP。

对于 9 种 Fluc-mRNA-LNP 来说，唯一的区别在于可电离脂质的尾部长度不同。这些 Fluc-mRNA-LNP 的水合直径在 50nm-170nm，Zeta 电位为 -10 至 10 mV(与中性表明电荷的 zeta 电位范围一致)。LNP 的封装效率有所不同，C10-200 和 C12-200 LNP 的包封效率超过 85%，C13-200 和 C14-200 LNP 的包封效率在 75%左右，其余的 LNP 的包封效率低于 70%。可电离脂质疏水性随着烷基尾长度的增加而增加。有趣的是，LNP 制剂之间可电离脂质疏水性的变化与相应的包封率变化并不是一致的。此外 LNP 尺寸大小和 Zeta 电位基本保持一致，并不会随着可电离脂质疏水性的差异而发生改变。总体来说，不同尾长的可电离脂质疏水性的差异并不会改变其制备的 LNP 的物理性质。

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检测不同尾长 FlucmRNA-LNP 递送效率

Fluc-mRNA，长度为 1929bp，编码荧光素酶蛋白。采用 Fluc-mRNA-LNP 转染 HepG2 细胞，转染比例为 20ng/20,000 细胞。孵育 24h 后，检测荧光信号，发现不同尾长的 LNP 的转染效率存在明显差异。与 C12-200-LNP 对照组相比，C10-200、C13-200 和 C16-200 LNP 的转染率显著增加。而且，这些测试的 LNP 均没有表现出特别明显的细胞毒性。

将 Fluc-mRNA-LNP 以 0.1 mg/kg 的剂量静脉注射到 BALB/cJ 小鼠，6 小时后，对小鼠实施安乐死，并对器官进行成像以评估荧光信号。与 C12-200 LNP 对照 组相比，C10-200 LNP 的肝转染率提高了 10 倍。然而，与体外结果相反，相对于 C12-200 LNP，C13-200 和 C16-200 LNP 并未增强发光通量。而且，研究者还发现 C10-200 LNP 和 C12-200 LNP 在肝脏中具有相同的积累，这就说明在肝脏中观察到 Fluc-mRNA-C10-200 LNP 荧光信号增强是由于两种 LNP 之间的内体逃逸能力出现差异所导致的。

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不同尾长 LNP 对于不同长度 mRNA 的递送效率

EPO-mRNA，长度为 858bp，编码肾小管周围细胞产生的糖蛋白激素。这种糖蛋白激素可刺激红细胞生成，已被用作慢性肾衰竭的治疗药物。将 EPO-mRNA-LNP 以 0.1 mg/kg 剂量静脉注射到小鼠中，通过眼眶后出血收集血液，分析 6h/30h 血液中的 EPO 浓度。在 6h 时， 与 C12-200 LNP 相比，C14-200 LNP、C13-200 LNP、C10-200 LNP 诱导的 EPO 血清浓度类似，远高于其他剩余 LNP。在第 30h 时，所有 LNP 诱导的 PO 血清浓度差异急剧缩小。C12-200 和 C13-200 LNP 均表现出在 6 小时至 30 小时内诱导的 EPO 产生减少了 10 倍，对于 C10-200 和 C12-200 LNP 来说，所以时间点诱导的血清 EPO 浓度类似，这与 C10-200 LNP 诱导的荧光素酶增加是相反的。

Cas9 mRNA ，长度为 4521bp，与 sgRNA 共同递送，可实现体内基因组编辑。将 Cas9 mRNA-LNP 以 0.5 mg/kg 剂量静脉注射到小鼠中，采用 NGS 分析基因组突变。与 EPO 研究类似，C10-200 和 C12-200 LNP 之间的插入缺失编辑率没有发现差异。有意思的是，C9-200 LNP 诱导了 35% 的插入缺失，而 C12-200 LNP 仅诱导了 10% 的插入缺失。与 C11-200 LNP 以外的所有制剂相比，C9-200 LNP 处理导致的插入缺失率更大。

总体来说，对于不同长度的 mRNA 来说，不同尾长可电离脂质制备的 LNP 递送效率是完全不相同的。

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小结

这项研究的重点在于探索不同尾长可电离脂质配制的 LNP 对于 mRNA 递送效率的影响。烷基尾部比对照组 C12-200 LNP 相比短 2 个碳原子的 C10-200 LNP，可将 Fluc mRNA 在肝脏中的递送效率提升 10 倍。对于更短的 EPO mRNA 来说，C13-200 LNP 与 C12-200 LNP 具有类似的递送效率。然而，对于长片段 Cas9 mRNA 来说，与 C12-200 LNP 相比，C9-200 LNP 诱导的插入缺失数量提升超过三倍。也就是说，mRNA 长度是优化 LNP 配制成分可电离脂质尾长的决定因素：短尾可电离脂质配制的 LNP 递送较大的 mRNA 的效率更高，而长尾可电离脂质递送较小的 mRNA 效率更高。

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