抗体-药物偶联物的偶联技术总结

抗体圈 · 公众号 · · 2025-05-07 13:26

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DAR4 偶联。而其他偶联技术（包括 DAR8 、 WuXiDAR4 和二硫键再桥接）则展示了位点特异性偶联能力。本综述根据它们在硫醇基团参与中的机制相似性，将上述所有技术归类为链间半胱氨酸偶联。与其他偶联方法相比，马来酰亚胺偶联物具有简单、条件可控和高产量等特点（图 1A ）。迄今为止，马来酰亚胺与还原的链间二硫键偶联仍然是 ADC 构建的主要方法。在 15 种具有强效毒性有效载荷的商业化 ADC 中，有 10 种和大多数处于临床阶段的 ADC 都使用了马来酰亚胺偶联技术（表 1 ）。

图 1：位点特异性偶联技术和链间半胱氨酸偶联过程的方案。（ A ）位点特异性偶联技术图示，突出关键反应机制和偶联位点。（ B ）链间半胱氨酸偶联过程与（ i ）半胱氨酸偶联、（ ii ） WuXiDAR4 和（ iii ）再桥接的不同策略的图示。由于范围限制，本综述未对所有可用的生物偶联化学试剂进行全面综述。相反，它旨在展示临床 ADC 管线中最普遍使用的偶联技术，或者那些在更广泛的治疗窗口或更简化的 CMC 工艺方面具有巨大潜力的技术。我们的目标是帮助新研究人员选择满足其要求的偶联技术。

马来酰亚胺 - 硫醇偶联物容易发生反向 Michael 加成反应，导致通过血清蛋白相互作用过早释放有效载荷。这种反向迈克尔加成反应会影响 ADC 在血浆中的稳定性，并降低其有效性和安全性。为了解决这个问题，科学家们探索了几种策略，包括通过引入其他基团（如 N- 芳基和邻位氨基）来催化马来酰亚胺的水解，或者用开环马来酰亚胺甲酯取代马来酰亚胺，以避免反向迈克尔加成反应。此外， KTHIOL™ 、 P5™ 和溴乙酰胺己酰等新型接头已显示出增强的硫醇选择性和对 retro-Michael 加成反应的耐受性。

此外，尽管可以通过优化还原试剂的量来很好地控制 ADC 产品的平均 DAR ，但通过部分还原和偶联实现的 ADC 的 DAR 分布仍然是异质的。第一三共的研究人员发现，在 4°C 下偶联可将 DAR4 物种的丰度提高到约 55% ，其中接头 - 有效载荷主要在 Fab 区域偶联。为了提高 ADC 的均一性，减少 DAR0 和 DAR8 等有害物质的影响，这两种物质都会显著影响 ADC 的疗效、 PK 和毒性，药明合联开发了 WuXiDAR4™ 偶联平台来解决这个问题。

WuXi DAR4™ 采用 “ 铰链屏蔽 ” 机制，其中 Zn 等金属离子 ²⁺ 在还原步骤中添加，与 IgG1 抗体重链之间的链间二硫键结合。这种选择性结合确保只有轻链和重链之间的二硫键被减少，允许接头 - 有效载荷在这些位置偶联，从而获得具有更高同质性的 ADC （超过 70% 的 DAR4 物种）。通过额外的柱色谱富集步骤，可以将均一性提高到 95% 以上。 WuXi DAR4™ADCs 在细胞来源的异种移植物（ CDX ）模型中显示出更高的疗效，在小鼠急性毒性试验中显示出更高的耐受性，表明其治疗窗口更广。使用这种方法的 7 个 ADC 已进入临床阶段。该工艺在天然人 IgG1 上运行，可靠且具有成本效益，商品成本与传统随机偶联相当。（图 1B ）。

获得均相产物的另一种方法是利用二硫键再桥接技术，完全还原四对二硫键并与接头 - 有效载荷偶联。二硫键再桥接涉及使用双巯基反应接头同时与一对半胱氨酸结合。有效载荷可以通过重新桥接二硫键直接引入，也可以在引入高反应性触发器后通过生物正交反应连接。这种方法保持抗体的形态并控制反应位点，通过改变接头上的有效载荷量，产物的 DAR 可调节到大约 4 、 8 或 16 。

二硫键再桥接技术中最成熟的试剂是二砜化合物。 2014 年，来自 Abzena 的 Godwin 小组使用二砜试剂合成了 DAR4% 为 78% 的 ADC ，显示出良好的血清稳定性和抗肿瘤活性。 OBIPharmaInc. 开发的 OBI-999 采用类似的原理，目前正在台湾和美国进行 II 期临床试验，已获得 FDA 治疗胰腺癌的孤儿药地位。除了二砜连接子外，还开发了各种其他再桥接连接子，例如新的马来酰亚胺连接子、哒嗪二酮连接子、 IDconnect™ 、 C-Lock™ 和 CysLink 。值得注意的是， 9MW2821 已进入 Mabwell 的 IDconnect™ 的 3 期临床试验， STI-6129 已进入 SorrentoTherapeutics 开发的 C-Lock™ 的 1/2 期临床试验。

然而，通过再桥接方法产生的 ADC 通常会导致两种异构体的混合物： “ 全抗体 ” 和 “ 半抗体 ” 物种（图 1 第 3 节）。与母体抗体相比， “ 半抗体 ” 物种的存在可能会影响 ADC 的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ ADCC ）活性二硫键再桥接技术不断发展，旨在解决 “ 半抗体 ” 异构体问题，提高血清稳定性，并增强这些 ADC 的安全性和有效性。 Chudasama 的小组通过将还原剂 TCEP 与吡哒嗪二酮接头相结合来修饰接头 - 有效载荷的结构。这种一锅法制备的 ADC 显著减少了半抗体的形成。然而，该试剂表现出与 TCEP 相同的不稳定特性，稳定性差，存在储存挑战。该研究小组随后优化了反应序列，首先添加接头 - 有效载荷，然后添加 TCEP ，同时降低偶联温度，从而提高了全抗体种类的产量。

关于 DAR8 技术， DS-8201 是第一个也是最著名的 ADC 获得 FDA 批准，具有 8 个在链间半年半胱氨酸中偶联的接头有效载荷。然而，完全减少链间二硫键是否会影响抗体的完整性和稳定性仍然存在争议。辉瑞的研究表明，具有高 DAR 的 ADC 会对生物物理特性和热稳定性产生负面影响。相比之下， Seagen 的研究结果表明，尽管 DAR8ADC 完全还原并与 PEG12-gluc-MMAE 连接，但仍能保持结构和稳定性。此外， Baker 和 Chudasama 报道，曲妥珠单抗的二硫化物完全还原和加帽显著影响 CD16a 动力学，这与