正文
，同时利用硫酯化学防止由于选择性切割反应而导致的聚集。
AJICAP
肽试剂在缓冲溶液中的稳定性得到改善，对靶标赖氨酸的选择性更高，
ADC
的
DAR
值更高。这种基于硫酯的策略提供了两种不同的
AJICAP
肽试剂，以访问两个不同的偶联位点（
Lys248
和
Lys288
）。基于
Lys248
和
Lys288
的
ADC
的体内生物学研究揭示了相当的疗效和耐受性。此外，还研究了偶联化学在非传统
ADC
生产中的应用。
【NO.2】结果与讨论
2.1.AJICAP
试剂设计和抗体修饰
改进
AJICAP
肽试剂有两个主要挑战（图
1c
）：（
1
）用抗体中赖氨酸的胺基取代不稳定的
N-
琥珀酰亚胺（
NHS
）基团，以及（
2
）在
ADC
合成方案中替换需要氧化还原处理的
AJICAP
试剂中的二硫键。
考虑到保质期和反应性平衡，选择噻吩酯基团作为抗体修饰的反应性基团。
硫酚基团比
NHS
基团具有更高的稳定性和略低的反应性。然而，我们预计
Fc
亲和肽的邻近效应会增强抗体修饰的反应性。此外，与
NHS
酯相比，噻吩酯在反应缓冲溶液中的保质期更长，从而提高了修饰产量和位点特异性。选择烷基硫酯键来替代
AJICAP
第一代试剂中的二硫键。烷基硫酯是众所周知的硫醇保护基团。
N-
琥珀酰亚胺
S-
乙酰硫代乙酸酯是一种广泛用于蛋白质功能化的烷基硫酯试剂。使用
N-
琥珀酰亚胺
S-
乙酰硫代乙酸酯修饰蛋白质赖氨酸，然后使用羟胺进行特异性脱保护，可以在赖氨酸残基上形成巯基。由这些硫酯（烷基和苯基）生产优化的
AJICAP
试剂（
1b
）（
图
1
d;
支持信息（
SI
），
图
S1-S3
）。此外，设计了另一种具有不同亲和肽序列的
AJICAP
肽试剂（
6b
）来修饰抗体的
Lys288
（
SI
，
图
S4
和
S5
）。在以前的研究中，
Lys288
的修饰产量低于
Lys248;
因此，我们安装了刚性架构
(18)
使
AJICAP
试剂的反应性噻吩酯基团在缓冲条件下接近
Lys288
。
曲妥珠单抗和利妥昔单抗用于证明噻吩酯化学（
表
1
）
表
1.
位点特异性肽偶联
通过使用四极杆飞行时间质谱法（
Q-TOFMS
）测量肽抗体比（
PAR
）来计算抗体到偶联物的转化率（
SI
，图
S6-S10
)
和疏水作用色谱（
HIC
）
-HPLC
（
SI
，图
S11-S21
）
。
在之前的
Lys248
偶联中，
AJICAP
试剂（
1a
）提供更高的
PAR
（条目
1
）；然而，由噻吩基团组成的
AJICAP
试剂（
1b
）实现了进一步的反应性优化，以满足目标
PAR
并提高了
PAR=2
选择性（条目
2
）。在
Lys288
偶联的情况下，需要进一步的优化研究。在以前的研究中，第一代
AJICAP
试剂（
6a
）提供的
PAR
不足（条目
3
(10)
).
为了了解这种现象，我们对试剂
6a
和
6b
的碱肽（称为
Z34C
）与
Fc
蛋白的复合物进行了结构分析
;
(20,21)
从
Z34C
肽到抗体
Lys288
的预测距离比从
FcIII
样肽的预测距离远到
Lys248
（
SI
，
图
S22
）。这些结果表明，用于
Lys288
修饰的
AJICAP
试剂需要比用于
Lys248
修饰的
AJICAP
试剂更长的接头（
SI
，
图
S5
、
S8
和
S14
）。
因此，
我们调整了肽试剂的连接子长度。几个小组报道了独特的亲和引导蛋白质修饰技术；
在某些情况下，刚性结构，如哌嗪和
proline
在接头部分，是到达反应性基团以靶向氨基酸的强大工具，提高了转化率。这些报道促使我们筛选接头以提高
Lys288
的修饰效率，发现芳香环是一个合适的键。肽偶联步骤中的缓冲液
pH
值取决于
AJICAP
试剂的肽部分的结合亲和力
;
在
Lys248
偶联的情况下，
FcIII
样肽在酸性缓冲液（
pH
值约为
5.5
）中显示出最高的结合亲和力。另一方面，用于
Lys288
偶联的
Z34C
在微碱性条件下（
pH
值约为
8.0
，数据未显示）显示出良好的亲和力。
在两种试剂（
1b
和
6b
）中，使用羟胺完成了以下接头切割（
SI
，图
S15
、
S16
、
S20
和
S21
），表明噻吩基团与抗体中的赖氨酸反应，而在肽偶联过程中没有通过烷基硫酯发生副反应。
2.2. AJICAP
技术的能力
通过
HIC-HPLC
分析评估了使用多种抗体的这种偶联化学试剂的兼容性（
SI
，
图
S23-S44
）
。在传统的半胱氨酸偶联情况下，抗体特性会影响所得
ADC
的反应性和
DAR
；因此，使用具有不同等电点（
PI
）的多个
ADC
进行共轭检查
(26)
旨在了解
AJICAP
第二代技术的反应耐受性。除了曲妥珠单抗（
PI=8.8
，条目
1
和
2
）和利妥昔单抗（
PI=9.1
，条目
3
和
4
