Nature Genetics | 颠覆传统！碱基编辑技术有望终结亨廷顿舞蹈症和弗里德赖希共济失调的...

生物探索 · 公众号 · 生物 · 2025-05-28 17:03

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亨廷顿舞蹈症（HD）患者基因中的CAG重复序列如果被同义的CAA三联体中断，疾病发病时间可以平均延迟约12年，甚至有研究表明可以延迟13-29年。对于弗里德赖希共济失调（FRDA），GAA重复序列中的GGA或GAG中断也与疾病症状减轻或发病延迟相关。这些天然存在的“暂停键”能够显著降低重复序列的不稳定性，抑制其在体细胞中的进一步扩增。这为我们提供了一个全新的治疗思路：既然天然中断具有保护作用，我们能否通过人工方式，精准地引入这些中断呢？

基因编辑的“利刃”——碱基编辑技术登场

传统的基因编辑技术，如CRISPR-Cas9，通常会引起DNA双链断裂，这可能带来不可预测的基因组改变。而碱基编辑（Base Editing）则是一种更为精准的基因编辑技术，它能够在不引起DNA双链断裂的情况下，直接将基因组中的一个碱基对（Base Pair）精准地转换为另一个碱基对。这就像是在遗传密码的“书页”上，只修改一个“字母”，而不是撕掉一整页，极大地提高了编辑的精确性和安全性。

这项研究利用了两种主要的碱基编辑器：

胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine Base Editor, CBE）：能够实现C•G到T•A的转换。在本研究中，用于亨廷顿舞蹈症（HD）的CAG重复序列编辑，旨在将其中的CAG转换为CAA。

腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editor, ABE）：能够实现A•T到G•C的转换。在本研究中，用于弗里德赖希共济失调（FRDA）的GAA重复序列编辑，旨在将其中的GAA转换为GGA或GAG。

通过设计，这些碱基编辑器可以模仿自然界中存在的稳定、非致病性等位基因（Alleles）中的中断，将致病性重复序列的“单调”打破。

亨廷顿舞蹈症的“静默舞者”——CAG重复序列的精准编辑

亨廷顿舞蹈症（HD）是一种由HTT基因中CAG重复序列扩增引起的进行性神经退行性疾病，导致运动、认知和精神障碍。研究人员的目标是引入CAA中断，将“致病性舞蹈”变为“静默舞者”。

体外细胞实验的振奋成果

研究首先在人类细胞（HEK293T细胞和HD患者来源的成纤维细胞）中验证了CAG-CBE的有效性。研究人员优化了胞嘧啶碱基编辑器（CBE）的策略，发现名为EA-evoA-32NLS的编辑器表现出最高的编辑效率（64±4.8%），同时具有最高的靶向产物纯度（81:1）。

在亨廷顿舞蹈症（HD）患者来源的成纤维细胞系中（这些细胞携带48-180个CAG重复序列的致病性HTT等位基因），通过信使RNA（mRNA）电穿孔（Electroporation）导入碱基编辑器和引导RNA（sgRNA）。在电穿孔5天后，观察到：

高达66-82%的已处理细胞中的致病性CAG重复序列中引入了中断。

编辑效率在长的致病性HTT等位基因上比短的野生型等位基因高出约1.1-1.3倍，表明长的重复序列提供了更多的编辑机会。

通过长期培养这些细胞，观察到未经处理和模拟编辑的细胞在30天后，CAG重复序列大小显著增加，最常见的CAG等位基因增加了约6个重复单元。

然而，经过CAG-CBE处理的HD成纤维细胞，在30天后未表现出重复扩增，最常见的CAG等位基因反而减少了约5个重复单元。这表明，引入中断不仅可以阻止扩增，甚至能促进致病性重复序列的缩短。

小鼠体内验证：CNS中的显著改善

为了评估CAG-CBE在体内的效果，研究人员使用了Htt.Q111亨廷顿舞蹈症（HD）小鼠模型。这种小鼠携带人源化HTT等位基因，包含约109-122个CAG重复序列，并在中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）中表现出年龄依赖性体细胞不稳定性。

研究人员通过AAV9病毒载体递送优化后的CAG-CBE（EA-evoA-32NLS-NG和sgCTG）至Htt.Q111新生小鼠大脑侧脑室（ICV）中。

转导效率： AAV9病毒在皮层（Cortex）的平均转导效率达到50±10%，在纹状体（Striatum）达到31±12%，这与早期AAV9研究报告一致。

编辑水平：给药4周后，小鼠皮层细胞中约有24±1.6%的等位基因被引入CAA中断，纹状体细胞中约有5.6±1.2%。这一比例在12周后持续增加，皮层达到33±8.3%，纹状体达到22±3.0%。到24周时，皮层中编辑等位基因的比例稳定在34±6.0%，纹状体为26±6.0%。这意味着，在被转导的GFP阳性细胞核中，到24周时，皮层和纹状体中分别有约**76±12%和72±13%**的HTT等位基因携带一个或多个CAA中断。

对重复扩增的影响：研究人员对CAG重复序列长度进行了定性和定量分析。结果显示，与对照组相比：

在给药12周后，CAG-CBE治疗显著降低了皮层中CAG重复序列的平均大小（不稳定指数ICAG减少了约1.6±0.5个重复单元，P=0.0064），纹状体减少了约2.8±0.5个重复单元（P=0.0009）。

到给药24周后，这种效果持续存在，皮层中ICAG减少至约2.2±0.9个重复单元（P=0.0265），纹状体减少至约5.4±0.9个重复单元（P=0.0003）。

这些数据明确证实，在亨廷顿舞蹈症（HD）小鼠模型中，通过AAV9递送碱基编辑器能够有效在中枢神经系统（CNS）中引入CAA中断，从而显著减少致病性HTT基因CAG重复序列的体细胞扩增。

弗里德赖希共济失调的“基因重构”——GAA重复序列的创新干预

弗里德赖希共济失调（FRDA）是最常见的遗传性共济失调，由FXN基因内含子（Intron）中GAA重复序列扩增引起，导致frataxin蛋白表达不足。该研究旨在引入GGA或GAG中断，实现“基因重构”。