正文
(e) 短处理时间与高通量能力；以及 (f) 可扩展性。
选择适当抗体基础整体柱的标准总结在图5.1A中。图5.1B展示了一个使用免疫亲和整体柱分离干细胞的例子。回收干细胞的原理是将特定单克隆抗体（mAb）固定在整体支撑材料上，该抗体是感兴趣干细胞表面抗原的互补配体。然后，当细胞样品注入亲和整体柱（图5.1B.1）[在允许表面抗原与固定化mAb强烈结合的条件下（缓冲液A）]时，具有特定细胞表面受体的干细胞将可逆地结合到整体柱上，而样品的其余部分将在这一步骤中从整体柱中洗脱。接下来，进行洗涤步骤以完全洗脱与固定化配体相互作用较弱的细胞（图5.1B.2）。接下来的步骤是注入洗脱缓冲液以使目标从亲和配体上解离（图5.1B.3）。为此，通常需要改变缓冲液条件（缓冲液B）（例如改变极性、pH或离子强度），并收集洗脱的干细胞以供后续分析或使用。最后，在洗脱后，必须通过注入缓冲液A（图5.1B.4）使整体柱再生，以便在下一个样品应用之前使用。
优势和局限性
整体柱具有独特的特性和特征，使其在广泛的制备和分析纯化应用中表现出色。例如，它们高度互连的通道网络允许在高洗脱流速下产生低背压。这使得操作速度更快，压力降更低，同时不损害操作的动态容量、渗透性和分辨率。此外，操作时间大幅减少，最大限度地减少了产品降解和缓冲液消耗。整体柱还具有多功能性，因为它们可以制造成各种尺寸（从0.1 mL到8 L；适用于制备和分析过程）、形状（圆盘、薄膜、柱、管、棒、冷冻凝胶、毛细管、微芯片）和表面化学性质（适用于离子交换、疏水性、亲水性、亲和性和反相色谱）。它们易于操作（安装、清洁和储存）、坚固、可重复、无需填充、可用于传统色谱系统、允许通过在同一个外壳中组装多种分离机制（例如阳离子、离子和/或疏水性）进行过程集成，并且与其它技术（质谱和微分析系统）兼容。此外，整体柱的机械和化学稳定性赋予分离系统良好的使用寿命，从而允许重复使用支撑材料以实现成本效益高的生物加工。关于可扩展性，鉴于不同可用的商业容量，可以在制造规模上实施整体柱。所有这些优势使整体柱成为将在下一节中进一步讨论的广泛治疗应用的灵活技术。
最后，整体柱可以作为冷冻凝胶在内部生产，但它们也可以从众多制造商处商业购买，包括BIA分离公司、Bio-Rad实验室、Dionex、默克、Phenomenex、安捷伦科技和赛多利斯。
尽管整体柱是用于生物治疗药物纯化和浓缩的卓越生物处理单元，但仍存在一些局限性，需要解决这些问题，才能将整体柱确立为临床、生物医学和制药领域的黄金标准纯化策略。这些局限性包括整体柱缺乏作为任何给定治疗产品的通用下游解决方案，因为抗体-抗原相互作用具有高度特异性。因此，需要根据必须纯化的特定分子将不同的抗体连接到整体柱上，例如，用于纯化不同病毒株。抗体基础整体柱的第二个局限性是连接抗体的可用性和生产成本。第三个限制与抗体和抗原之间的强亲和力相互作用有关，在生理条件下，其结合平衡常数通常大于10^6 M^-1，需要极端的洗脱条件（通常是低pH）来逆转结合。如果目标的稳定性和功能状态受到影响，这可能会限制这种纯化策略的应用。另一个限制是，尽管可以商业购买高达8 L体积的整体柱（例如BIA分离公司的CIMmultus柱），但由于与孔分布、开裂和高生产成本相关的制造复杂性，大于1 L的亲和整体柱仍然不可用。最后一个但也是最重要的障碍是将现有生产中的正在进行的生物处理过程转变为使用抗体基础整体柱的市场技术和经济影响。
最近抗体纯化的进展
鉴于抗体在多种治疗应用中显示出的潜力，无论是直接用于临床应用（治疗癌症、自身免疫性疾病、感染和炎症性疾病），还是作为其他技术（包括抗体基础整体柱色谱）中的试剂使用，抗体的受欢迎程度有所增加。单克隆抗体及其衍生物占目前在临床试验中测试的所有分子的很大比例。不同分类的抗体（单克隆、多克隆、重组和片段）通常使用免疫亲和色谱进行纯化，借助IgG结合蛋白，如蛋白A、G、L、M、D和P，其中蛋白A和蛋白G是最常用的配体。正如前面提到的，鉴于整体柱所表现出的卓越优势，整体柱用于抗体纯化并不令人惊讶。表5.1中列出了使用整体柱对抗体进行定量和纯化的一些例子。 这些例子表明抗体基础整体柱在抗体纯化方面越来越受欢迎。这可以归因于它们与传统色谱支撑材料相比所具有的多种优势，突出其速度和易用性。此外，通过分析文献可以进一步验证这一点，因为每篇关于抗体纯化的综述都包含一个亲和整体柱的部分。
最近抗体固定的进展
如前所述，有两种不同的选择可以将抗体固定在整体柱上：(a) 与支撑材料共价固定，或(b) 非共价固定方法。共价策略可以根据抗体是直接还是间接连接到整体柱上进一步细分为两个子类别。在直接共价固定中，已报道了不同的偶联技术（例如环氧、腙），这些技术可以使用静态（将整体柱浸入含有抗体的溶液中）或动态（将配体溶液注入整体柱）模式。以下将简要描述每种技术。在环氧方法中，整体柱中的环氧基团可以直接用于通过与抗体的氨基（这些氨基分布在抗体中并且易于接近）偶联来固定化，或者作为其他偶联方法的前体（例如在酸性条件下二醇）。
