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Fig. 3: Mutation accumulation in BCR::ABL1 cells.

- 图片说明

◉ a, 来自菌落的体细胞SNVs数量（n = 834），根据驱动状态（BCR::ABL1，红色；其他驱动突变，橙色；野生型（WT），蓝色）和与年龄的关系进行着色，并通过混合效应模型回归线和按BCR::ABL1状态分层的95％置信区间表示（红色，BCR::ABL1阳性；灰色，BCR::ABL1阴性，由于缺乏野生型，模型排除了PD57332，n = 799）。 ◉ b, 一个患者的系统发育树示例PD51632，显示了每个分支上SBS签名SBS1、SBSblood和SBS18对SNVs贡献的估计比例，分为五组：（1）BCR::ABL1阳性克隆扩展（'CML'）的分支，（2）代表CML起源谱系的BCR::ABL1菌落祖先分支（'前CML谱系'），（3）CML内的早期突变（即，在克隆扩展内的共享分支，'早期CML'，下紫色阴影框），（4）BCR::ABL1阴性菌落（野生型，WT）的分支，（5）早期生活中的突变，代表系统发育树上的前100个突变，上蓝色阴影框。 ◉ c, PD51632的SBS1、SBSblood和SBS18对SNV光谱贡献比例的条形图，条形的高度表示后验均值，误差棒表示95％可信区间。 ◉ d, PD51632中C>T在CpG变化中的比例条形图。条形的高度表示观察到的比例，误差棒表示95％二项比例置信区间。 ◉ e, 排除PD57333和PD57332的队列范围内的C>T在CpGs、SBS1、SBS18和SBSblood比例图，因为这些患者缺乏野生型或突变菌落。点表示混合效应元分析估计的比例，条形表示95％置信区间。P值是对零假设的双侧检验，该假设认为比例之间的差异为零。P值未针对多重测试进行调整。 ◉ f, PD51635的每个样本点图，显示了C>T在CpG比例（排除BCR::ABL1阳性菌落中的BCR::ABL1分支克隆主干）的样本BCR::ABL1状态，按采样时间分面并注释了每个样本的驱动状态。 ◉ g, PD51635中每个样本的平均端粒长度（bp）按采样时的年龄分类，标注了驱动状态和按BCR::ABL1状态分层的混合效应模型回归线及95％置信区间。 ◉ h, PD51635中描述平均端粒长度（bp）按克隆状态（BCR::ABL1，另一种驱动突变或'无驱动'克隆扩展）的每个样本点图，按采样时间分面并注释了每个样本的驱动状态。

Para_02

1. 我们认为这些增加的突变是由于新的或现有的突变过程引起的。
2. 在BCR::ABL1阳性和阴性的菌落中，除了SBS18之外，还存在预期的内源性时钟样突变过程（单碱基替换（SBS）特征SBS1和SBSblood）（图3b、c）。
3. 没有发现额外的突变过程，这与之前关于BCR::ABL1诱导的DNA损伤的报告相反（20）。
4. 然而，我们没有发现TKI诱导的突变，但在BCR::ABL1阴性的菌落中观察到了反复出现的8号染色体三体性（图1f和2）。
5. 这可能反映了在CML发展过程中8号染色体造血干细胞的增殖或生存增加，或者随后被TKI选择性地正向选择。

Para_03

1. 为了探索现有的突变过程如何导致BCR::ABL1阳性细胞中的突变负担增加，我们将突变特征分配给系统发育树的各个分支（图3b和扩展数据图3和4），按（1）BCR::ABL1阴性（野生型）分支，（2）代表前CML系的BCR::ABL1克隆共享分支，（3）代表早期CML克隆扩增的历史早期BCR::ABL1克隆共享分支，（4）包括最近突变的所有BCR::ABL1克隆分支，以及（5）生命早期分支。
2. 在BCR::ABL1克隆中观察到SBS1突变的比例增加（图3c和扩展数据图3，+13.6–30.9%，P=4.0×10^-11）。
3. 这与在CpG位点观察到的C>T转换比例增加相呼应（图3d和扩展数据图4，+16.6–31.3%，P=2.9×10^-11）。
4. 这反映了由于细胞分裂增加导致的甲基化胞嘧啶自发脱氨基作用增加（图3e）。
5. 类似的现象也出现在SBS18中，该现象在胎儿造血快速生长环境中19和胎盘组织22中也有观察到。
6. 总体而言，我们的数据显示，CML细胞中的突变增加仅仅是反映了它们更高的细胞分裂率。

Para_04

1. 我们观察到，在前CML谱系（BCR::ABL1分支的共享分支）和野生型HSPCs之间没有发现突变模式的差异（图3e）。
2. 这证实了CML起源细胞在被BCR::ABL1转化之前获得了与正常HSPCs相似的突变，这可能发生在长共享分支的末端。

Para_05

1. 多年后诊断出BCR::ABL1阳性的菌落是不寻常的，因为大多数患者处于分子缓解状态。
2. PD51635具有临床稳定的低BCR::ABL1/ABL1比率（0.5%）在TKI治疗下（扩展数据图1），
3. 他们两个采样的BCR::ABL1阳性菌落（图2）与诊断时的BCR::ABL1阳性基因组相比，在CpG位点上C>T的比例较低（平均0.18）（图3f），
4. 这表明尽管这些谱系携带着BCR::ABL1，但它们仍然以正常速率分裂。
5. 我们确认这些菌落和诊断样本中的BCR::ABL1易位事件是相同的。
6. 这一不寻常的观察提出了几种可能性：
7. 一是TKI疗法导致仅快速分裂的BCR::ABL1突变细胞被优先清除，
8. 二是TKI疗法减缓了某些BCR::ABL1阳性细胞的分裂速度，
9. 三是BCR::ABL1的下游后果在这种患者的表观遗传上被沉默。
10. 竞争性克隆造血或免疫调节也可能限制了剩余BCR::ABL1细胞的分裂速度。

Telomere lengths in CML

Para_01

1. 端粒是位于染色体末端的重复DNA序列，随着细胞分裂而缩短，是细胞分裂历史的直接读出。
2. 在健康的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中，端粒损耗已被证明每年约为30个碱基对，与这里观察到的野生型细胞相似（n = 469，每年-30.8个碱基对，CIboot -12.6至48.2个碱基对）。
3. 模型截距提供了出生时估计的端粒长度，为6,180个碱基对（CIboot 5,216至7,086个碱基对），与之前的估算一致（9）。
4. BCR::ABL1阳性的HSPCs（n = 365）尽管采样时年龄较轻，但端粒长度明显减少，额外损失了556.9个碱基对，且这一损耗独立于年龄（CI -86.0至993.2个碱基对，补充说明2和图3g）。
5. 我们注意到PD51635 BCR::ABL1阴性的HSPCs中的端粒异常短小，这可能反映了野生型区室内克隆性造血的细胞分裂历史增加（图3h）。

Timing and rate of BCR::ABL1 expansion

Para_01

1. 我们通过建模在克隆扩展开始前以恒定速率积累突变来计算BCR::ABL1克隆扩展的起始时间，之后突变的获取速率更高，如上所示。
2. 共线性的时机是使用我们改进的适应于考虑在长‘树干’末端发生的转化事件的Markov链Monte Carlo方法rtreefit23推断出来的，该事件发生在克隆扩展之前（补充说明3）。
3. 使用这些基于时间的树，我们接下来使用我们的phylofit7工具估计生长速率，该工具假设一个S形克隆生长曲线。
4. 指数增长阶段的前期范围上限s增加，直到后验估计的s对进一步增加不敏感（扩展数据图5a）。
5. 我们报告年化增长率S = es − 1，以百分比形式表示，并与瞬时每年增长率s一起报告，在一个小的时间段δt内，以年为单位测量，克隆大小的分数增加大约是sδt。

Para_02

1. 在两名最年轻的患者（PD57334，22岁；PD56961，36岁）中，从克隆扩增的发作到临床诊断的时间仅为3.2年（置信区间CI 2.4–4.2年）和3.9年（置信区间CI 3–5.3年，图4a和补充表3和5）。
2. 根据最近的肿瘤起源估算，增长速率非常高，分别为每年99,000,000%（置信区间CI 906,000–13,500,000,000%，s = 13.81，置信区间CI 9.11–18.72）和每年26,800%（置信区间CI 11,800–63,000%，s = 5.59，置信区间CI 4.78–6.44，图4b和补充表3和5）。
3. 这相当于突变克隆群每18到45天翻一番。
4. 三名中年患者（45-55岁，PD51632、PD51634、PD57335）也有近期和快速的BCR::ABL1克隆扩增至诊断，时间范围从4.4年（置信区间CI 3.4–5.8年）到6.3年（置信区间CI 5.0–8年），增长速率从每年73,500%（置信区间CI 24,000–240,000%，s = 6.60 置信区间CI 5.49–7.78，PD57335）到每年2,700%（置信区间CI 1,700–4,300%，s = 3.33 置信区间CI 2.89–3.79，PD51634）不等（图4a、b和补充表3和5）。

Fig. 4: Timing and fitness of BCR::ABL1-driven clonal expansion.

- 图片说明

◉ 条形图显示了基于rtreefit的潜伏期（以年为单位）（a）和基于phylofit的方法（方法）的年度化增长率（百分比）（b），患者按诊断时的年龄排序。 ◉ 条形图的高度和垂直线分别表示后验中位数和等尾95％可信区间。 ◉ 顶部的条带表示突变转录类型以及内含子与外显子非框内BCR和ABL1断点。 ◉ 星号*表示非互惠性BCR::ABL1易位伴有der(9)丢失。 ◉ 达到主要分子缓解（MMR）的时间（通过国际标准确定BCR::ABL1/ABL1比率小于0.1％）显示在下方。 ◉ NR表示未达到MMR。 ◉ **PD57334和PD57335的随访时间分别为23个月和21个月。 ◉ c，推断的BCR::ABL1获得（年）与每年BCR::ABL1阳性克隆的年度化增长率（％）之间的关系。 ◉ 点基于S和潜伏期的后验中位数估计，拟合线和95％置信区间（灰色带）来自线性模型log(log(1 + S)) ~ log(latency)。 ◉ d，估计的倍增时间(=1/log2(1+S))与从BCR::ABL1诱导的克隆扩增到诊断的时间（'潜伏期'）的关系。 ◉ 拟合线和95％置信区间（灰色带）来自c中使用的线性模型。 ◉ e，f，描述在PD60243中发现的晚期阶段（81.3年）和急变阶段（81.7年）的克隆广泛结构的鱼状图（e）和树状图（f）。 ◉ 通过基于读取的相位确认ABL1突变克隆存在于不同细胞中。 ◉ 树重建预测了中位数为2（范围1-3）的ABL1突变克隆嵌套在ABL1 p.F359V克隆内，一个例子如所示。 ◉ 鱼状图（e）y轴反映了每个测量时间点上推断的癌细胞比例，所示的克隆出现点仅用于说明。 ◉ 鱼状图（d）左侧的灰色部分（虚线和实线）代表具有单一（灰色虚线）和两个（灰色虚线）驱动突变的历史突变克隆：BCR::ABL1、RUNX1和DNMT3A；这些事件的顺序未知。 ◉ 树状图（f）展示了与e相同的树解决方案，并注释了相应亚克隆的常染色体SNV负担。 ◉ 虚线表示可能的分支结构。 ◉ 框用相应的克隆分数标记，对应于急变阶段样本PD60243d。 ◉ 来源数据

Para_03

1. 相比之下，在三位年龄分别为52岁（PD51633）、61岁（PD51635）和81岁（PD57332）的患者中，我们观察到了稍长的克隆轨迹，分别为13.1年（置信区间10.5-16年）、14.0年（置信区间12.0-16.2年）和10.3年（置信区间7.9-13.4年）。
2. 这些患者的克隆扩增速度处于中间水平，但仍然达到了每年114%-245%的增长（标准差为0.76-1.24，图4a、b所示）。值得注意的是，PD51635患者的生长速率起初似乎较慢（根据较长的共祖先区间判断），然后在一个亚克隆中变得更快（图2和补充表3、5所示）。

Para_04

1. 鉴于如此快速的推断生长率，我们使用phylofit进行了基准测试，以评估是否可以准确推断出较大的生长率（补充说明3）。
2. 使用cloneRate24（'maxLikelihood'和'birthDeathMCMC'）进行的正交生长率估计给出了相似的生长率估计（扩展数据图5b和补充表4），为CML中的非常高的估计生长率提供了额外的支持。
3. 一个显著的例外是PD57335，在突变株系中后期合并对cloneRate估计有明显影响，但在使用phylofit时则没有（补充表4）。
4. 正如之前报道的那样24，phylofit可信区间比cloneRate的更不保守。

Para_05

1. 考虑到患者数量较少，似乎有一个合理的趋势，即发病年龄越小，与BCR::ABL1克隆扩增开始到诊断的时间较短以及增长更为迅猛相关（图4a、b），而年龄较大的个体则显示出相对较不迅猛的克隆扩增。
2. PD51632是这些趋势的一个轻微异常值，因为在CML诊断前的8个月内曾接受过化疗治疗结直肠癌，这可能增强了对BCR::ABL1阳性HSPCs的选择。

Para_06

1. 我们探讨了慢性髓性白血病（CML）生长速率差异的临床意义及临床反应。
2. 队列中最快速生长的三种CML均未能在12个月内达到最佳分子缓解（根据国际标准定义为BCR-ABL1/ABL1比率小于1％），原因是TKI引起的细胞减少和BCR::ABL1水平降低缓慢（扩展数据图1）。
3. 相比之下，在最年长患者中最慢生长的两种CML克隆却实现了快速的主要分子缓解。
4. 这些观察结果提示，CML中的生长速率可能影响早期治疗反应。

Para_07

1. 尽管在这小范围内观察到的临床表现模式各不相同，我们观察到 CML 的推断生长速率与临床表现时间之间有很高的相关性（图 4c、d）。
2. 鉴于这两个参数是从树的不同特征中推断出来的，即克隆扩增开始时患者的年龄与克隆扩增内的合并模式（图 2 和方法部分），这种模式令人瞩目。
3. 这一观察结果提供了证据，证明可以根据肿瘤生长速率预测临床表现，并表明在不可避免的临床表现之前，CML 白血病干细胞的人口规模有一个可以容忍的上限（补充说明 4）。

Disease progression in CML

Para_01

1. 进展到慢性髓性白血病（CML）的爆发期与RUNX1、BCOR、TP53、ABL1、+8和等臂染色体17q（i(17q)）中的额外突变有关。
2. 配对的外显子组和目标基因测序在CML进展前后也显示突变负担增加。
3. 我们通过外周血单核细胞或粒细胞DNA的全基因组测序，分析了四名年龄在38至81岁之间的晚期CML患者，这些患者的特征是循环中的原始细胞数量升高（10-19%）。
4. 在所有病例中，我们观察到了BCR::ABL1克隆内的进一步驱动突变，例如RUNX1 p.Arg166 、ASXL1 p.Tyr59fs、ASXL1 p.G646fs 12和BCOR p.Leu532fs，以及拷贝数改变，如+1q、−16q、+8和i(17q)（补充表6）。
5. 带有额外驱动因子的BCR::ABL1扩展，主导了CML克隆，几乎不留历史上的仅含有BCR::ABL1的克隆的证据。
6. 这与本研究中的慢性期CML形成对比，在慢性期CML中，大多数情况下（八例中有六例），BCR::ABL1克隆内的额外驱动因子要么不存在，要么处于低水平。
7. 在两个慢性期病例中，我们确实观察到了额外驱动突变的高克隆负荷：胎儿期NF1移码突变（PD51634）和RUNX1突变（PD57332）。
8. PD51634随后发展为CML的爆发期，而PD57332在接受治疗后不久去世，疾病阶段尚不确定。
9. 这些数据显示，晚期CML主要是由基因组驱动的，特征是获得额外驱动突变的BCR::ABL1克隆，这些突变提供了进一步的选择优势。

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