主要观点总结
研究人员利用噬菌体辅助连续进化（PACE）技术，成功改造出进化版的基因搬运工——evoCAST系统，可以在人类细胞中实现高效、精准、DSB-free的基因插入。该系统的出现为基因治疗领域提供了新的技术支撑，并展示了在遗传病治疗、细胞疗法等领域的应用潜力。
关键观点总结
关键观点1: 研究背景
自然界中的CAST系统具有利用CRISPR的定位能力，将DNA片段精准地插入特定基因组位点的潜力，但在人类细胞中的活性较低。
关键观点2: 研究创新
研究人员采用PACE技术，通过进化改造提高了CAST系统在人类细胞中的活性，诞生了全新的evoCAST系统，具有高效、精准、大片段兼容性等特点。
关键观点3: 系统特点
evoCAST系统能够实现高达19%的基因插入效率，具有精准度高、产物纯度高等优点，并且能够兼容大片段DNA的插入。
关键观点4: 应用前景
evoCAST系统在遗传病治疗、细胞疗法等领域具有广泛的应用前景，为基因治疗领域提供了新的技术支撑。
关键观点5: 研究方法
研究人员通过设计特定的引导RNA，利用PACE技术进化改造CAST系统，并结合理性工程优化，最终诞生evoCAST系统。
正文
自然界的“搬运工”：CRISPR辅助转座酶(CASTs)初探
什么是CASTs？它们是一类发现于细菌中的天然系统。顾名思义，它们结合了CRISPR的靶向能力和转座酶（transposase）的“搬运”能力。简单来说，CAST系统利用无核酸酶活性的CRISPR-Cas组件（通过引导RNA, guide RNA定位），将一段DNA片段（称为转座子, transposon或payload）精准地插入到基因组的特定位置。
RNA引导编程性（RNA-guided programmability）：
只需要设计特定的引导RNA，就能靶向不同的基因组位点，非常灵活。
无需DSBs（Avoidance of genomic double-strand DNA breaks）：
这是CASTs最显著的优势之一，理论上可以避免DSB带来的诸多副作用。
大片段DNA兼容性（Compatibility with multi-kilobase-scale DNA cargo）：
它们天然就能插入较大的DNA片段。
听起来很完美？但自然界的设计往往有其自身的考量。研究发现，目前已知的天然CAST系统在人类细胞中的整合效率极低，通常低于0.1%。这可能是因为在细菌宿主中，过度的转座活动会带来适应性成本（fitness cost），所以天然进化可能倾向于抑制转座酶的活性，使其“够用就好”，而不是追求最高效率。
让分子“加速进化”：噬菌体辅助连续进化(PACE)登场！
既然天然CASTs在人类细胞中“水土不服”，那我们能否像培育农作物或更高效的酶一样，在实验室里对其进行“定向进化”呢？答案是肯定的！
这项研究引入了
噬菌体辅助连续进化（Phage-assisted continuous evolution, PACE）
技术。PACE是一种强大的体外（in vitro）进化平台，它将传统的、耗时的蛋白质定向进化步骤（突变、选择、扩增）“嫁接”到M13噬菌体的生命周期上。在PACE系统中，编码待进化蛋白质的基因被整合到噬菌体基因组中，并取代一个对噬菌体复制至关重要的基因（如基因III, gIII）。噬菌体在宿主细菌中生长，宿主细菌内含有一个特殊的“选择回路”（selection circuit），该回路的设计使得只有当噬菌体基因组上编码的蛋白质执行了我们期望的功能时，才能激活gIII的表达。gIII蛋白是噬菌体组装和释放所必需的，因此，只有成功执行功能的噬菌体才能有效复制、传播。同时，噬菌体种群通过持续稀释（continuous dilution）被施加生存压力，只有复制速度足够快的噬菌体才能在系统中存活下来。结合诱导性的突变质粒（mutagenesis plasmid），噬菌体种群在高速复制的同时积累突变，那些编码功能更强的蛋白质的噬菌体因为复制更快而被富集，从而实现蛋白质的快速定向进化。
PACE的优势在于其速度快、通量高、能够探索巨大的序列空间，而且对蛋白质的先验知识要求低。
研究人员正是利用PACE来改造PseCAST系统，希望能获得在人类细胞中具有高整合活性的变体。
千锤百炼，铸就“进化”引擎：CASTs核心组件的演进之路
CAST系统包含多个组件，其中TnsA、TnsB和TnsC（统称为TnsABC）构成了执行DNA转座的核心转座酶模块。研究人员最初尝试进化整个TnsABC模块。他们设计了PACE选择回路，将TnsABC的转座活性与噬菌体复制关联起来：只有当TnsABC将编码gIII启动子的转座子插入宿主细菌基因组的特定靶点上游时，gIII才会表达，噬菌体才能复制。
然而，最初的进化尝试遇到了挑战。天然PseCAST在宿主大肠杆菌（E. coli）中虽然具有较高的整合活性（>99%），但在他们的PACE体系中，野生型TnsABC驱动的噬菌体复制速度慢到不足以维持种群。通过非连续的噬菌体辅助进化（PANCE，一种更宽松的模式），第一轮进化（N1）后，噬菌体在过夜培养中表现出约10³倍的繁殖提升，并在靶点上的整合率提高了320倍，表明进化成功地将噬菌体繁殖与整合活性关联了起来。
但随后，他们发现快速复制的噬菌体中出现了“作弊者”（cheating SPs），它们通过其他方式获得了gIII基因，绕过了选择压力。为了应对这个问题，他们改进了选择回路，使用了分裂的gIII基因（split-intein gIII）以及更大的宿主质粒（accessory plasmid, AP），使得“作弊”更难。
在后续的进化中，他们发现进化TnsABC（N2轮）虽然在人类细胞中的整合活性提高到约3.6%，但随后进一步进化的P2轮噬菌体虽然在细菌中复制得更快，其编码的TnsABC变体在人类细胞中的活性反而下降了。通过分析，他们发现P2轮TnsC蛋白上的一些突变（如D44G, D44N, N316D）虽然提升了噬菌体在细菌中的适应度，却降低了其在人类细胞中的整合效率。这有力地证明了针对细菌宿主进行的进化，其结果并不一定能直接转化为在人类细胞中的最优性能，因为细菌和人类细胞环境差异巨大（如染色质结构、DNA超螺旋、靶点搜索空间等）。
基于这些发现，研究人员将进化焦点进一步缩小，转移到TnsABC中最关键的催化亚基——TnsB上。他们设计了新的PACE回路（3.0），将TnsA和TnsC放在宿主质粒上，只进化噬菌体编码的TnsB。同时，为了避免进化出依赖于细菌内源ClpX蛋白的变体（因为人类细胞中ClpX可能引起细胞毒性），他们使用了敲除了ClpX基因的大肠杆菌宿主（ΔclpX E. coli）。
经过又一轮的PANCE（N4）和PACE（P4）进化，他们获得了活性显著提升的TnsB变体。其中表现最好的P4-15 TnsB变体，在人类HEK293T细胞中测试的三个基因组位点上，平均整合效率达到约12%。这个P4-15 TnsB变体总共积累了10个氨基酸突变，这些突变分散在蛋白的不同区域，并且通过回补实验证明，这10个突变都能提高TnsB在人类细胞中的活性。结构分析显示，这些突变位于TnsB与转座子DNA、TnsB自身以及TnsC的多个关键界面上，这表明进化改进了TnsB的多种功能，包括转座子末端结合（transposon end binding）和转酯催化（transesterification catalysis），这些正是之前鉴定出的限制PseCAST在人类细胞中活性的关键瓶颈。
更重要的是，与野生型PseCAST不同，进化的P4-15 TnsB对ClpX蛋白的依赖性大大降低。这意味着在人类细胞中，无需额外提供细胞毒性的ClpX蛋白，也能实现较高的整合效率。这对于未来的治疗应用至关重要。
