Nature Methods | 解锁植物细胞壁“功能地图”！“碳标签”：活体感知软硬、酸碱与信号

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总而言之，我们需要一种新的工具，它能： 1）特异性地结合植物细胞壁；2）能够快速渗透到组织深处；3）对活体细胞毒性低；4）具有模块化特性，能够连接不同的荧光探针或功能分子；5）最好不依赖于转基因技术，适用于更广泛的植物物种。

灵感源于自然：神奇的“碳标签”（CarboTag）登场！

研究人员将目光投向了大自然。植物自身就懂得如何与细胞壁结合——它们利用硼酸（boric acid）作为细胞壁成分（主要是果胶）的交联剂（crosslinker）。硼酸通过与多糖中的二醇（diol）形成可逆共价键来结合细胞壁。然而，普通苯硼酸（phenylboronic acid）与二醇形成稳定复合物的最佳pH范围在7到9之间，而植物细胞壁的质外体通常是偏酸性的，生理条件下的pH范围在4到8之间，这使得普通硼酸在这类pH下结合较弱。

研究发现，吡啶硼酸（pyridinium boronic acids）可以在更低的酸性pH下形成更稳定的复合物。基于这一发现，研究人员设计并合成了一个小分子结构—— “碳标签”（CarboTag） 。它是一个吡啶硼酸衍生物，并且携带一个可点击的炔基（alkyne group）。这个炔基就像一个“接口”，可以通过点击化学（click chemistry）这种高效、特异、反应条件温和的化学反应，方便地与携带叠氮基（azide group）的荧光探针或任何其他叠氮基化的分子连接。

这种模块化的设计是CarboTag的核心优势。它意味着，我们只需要合成一次CarboTag这个“导航仪”，就可以通过简单的点击化学反应，将各种各样的“货物”（cargo）——无论是不同颜色的荧光染料，还是具备特定功能的生物分子或小分子探针——“装配”到细胞壁上，而无需为每一种货物重新设计整个分子。

快！准！狠！CarboTag的超能力测试

CarboTag是否真能满足我们的需求？研究人员进行了一系列严格的测试。

首先，他们将CarboTag与常用的绿色荧光染料AlexaFluor488连接，得到了CarboTag-AF488探针。将活体拟南芥幼苗用CarboTag-AF488染色30分钟后，探针就清晰地标记了根部细胞壁网络，甚至渗透到了组织深处。作为对照，未经修饰的AF488染料则完全无法有效染色细胞壁。通过质壁分离（plasmolysis）实验，研究人员进一步证实，CarboTag确实是特异性地靶向细胞壁，没有可检测到的膜插入现象。

接下来，他们将CarboTag的渗透能力与CFW、SR2200和PI这些传统细胞壁染料进行了对比。结果令人振奋：CarboTag-AF488在短短15-30分钟内就完全渗透到了拟南芥根部组织中，1小时内达到饱和染色强度。而CFW和SR2200即使经过几个小时的孵育，渗透深度仍然有限。正如前面提到的，PI不仅毒性高，而且其染色效率依赖于低渗环境（hypotonic medium），这会对植物组织造成渗透胁迫。更重要的是，经过24小时暴露在CFW和SR2200中的根部出现了明显的细胞毒性迹象，而CarboTag-AF488在相同条件下则没有。这表明CarboTag探针具有更快的组织渗透速度和更低的细胞毒性。

CarboTag的快速渗透是否意味着它与细胞壁的结合力较弱？为了解答这个问题，研究人员进行了荧光漂白恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP）实验。FRAP测量荧光分子在漂白区域扩散恢复所需的时间，恢复越快通常意味着分子扩散越自由，结合力越弱。实验结果显示，在拟南芥根毛细胞中，CarboTag-AF488的荧光恢复半衰期（t1/2）显著长于CFW和SR2200。具体来说，CarboTag-AF488的半衰期约为360秒，而CFW约为80秒，SR2200约为60秒。这表明CarboTag与细胞壁的结合力实际上比CFW和SR2200更强。那么为什么它渗透更快呢？研究人员推测，这可能与CarboTag小分子、电中性的特性有关，使其更容易在细胞壁网络中扩散。

CarboTag的强大之处还在于它的普适性。研究人员发现CarboTag-AF488不仅能有效染色拟南芥，还能清晰标记多种植物物种的细胞壁，包括绿藻（Penium margaritaceum）、蕨类（Ceratopteris richardii）、苔藓（Physcomitrium patens）和地钱（Marchantia polymorpha）。这表明CarboTag所结合的细胞壁表位在这些物种中是保守的，即使它们的细胞壁成分存在显著差异。他们甚至成功地用CarboTag标记了拟南芥种子水合后周围富含果胶的粘质层（mucilage），揭示了其中复杂的纤维状结构。此外，CarboTag还能有效染色褐藻（brown algae）的细胞壁，如铜藻（Saccharina latissimi）和糖昆布（Saccharina latissidula），它们的细胞壁主要由藻酸盐（alginate）构成，缺乏果胶。CarboTag甚至能染色包含琼脂（agar）的培养基凝胶。这些结果共同指向了CarboTag的结合靶点可能是在水合状态下、二醇基团易于接近的多糖水凝胶（hydrogel），其中果胶、琼脂和藻酸盐都符合这一特征。

而CarboTag无法染色细菌（如大肠杆菌 Escherichia coli）和卵菌（oomycetes，如棕榈疫霉 Phytophthora palmivora）的细胞壁，这些生物的细胞壁成分与植物不同（细菌细胞壁含肽聚糖，卵菌细胞壁含纤维素），这进一步佐证了CarboTag对植物细胞壁特定成分（如果胶）的特异性。

模块化设计的优势体现在其光谱灵活性。通过将CarboTag与不同颜色、带有叠氮基的市售荧光染料结合，研究人员轻松构建了一系列覆盖可见光谱范围的细胞壁探针，如CarboTag-AF430（蓝绿色）、CarboTag-AF488（绿色）、CarboTag-sCy3（黄色/橙色）和CarboTag-sCy5（远红）。这些不同颜色的探针可以用于多重标记（multiplexing），例如同时标记细胞壁和基因编码的荧光蛋白（如标记肌动蛋白 ABD2-mCherry 或微管蛋白 MAP65-RFP），这对于研究细胞壁与细胞骨架等结构的相互作用至关重要。CarboTag探针也与高分辨率成像技术（如AiryScan）兼容，能够实现对细胞壁更精细结构的观察。

细胞壁的“软硬”秘密：CarboTag带你看孔隙

细胞壁不仅是静态的屏障，更是动态变化的结构。它需要在承受巨大膨胀压力的同时，允许细胞生长和扩张。这种机械特性的动态调节是植物发育的关键。那么，细胞壁的“软硬”或者说网络结构如何变化呢？

研究人员利用CarboTag开发了一种新的功能探针来探测细胞壁的孔隙度（porosity）和结构变化——CarboTag-BDP。CarboTag-BDP的核心是一个特殊的荧光团——BODIPY分子转子（molecular rotor）。这类分子在被光激发后会发生分子内旋转（intramolecular rotation），这种旋转是非辐射过程，会消耗能量，导致荧光寿命（fluorescence lifetime）降低。分子周围环境的粘度（viscosity）或空间阻碍越大，分子转子的旋转就越困难，荧光寿命就越高。因此，CarboTag-BDP的荧光寿命可以作为探测其所处细胞壁环境中分子运动受阻程度的指标，从而间接反映细胞壁，特别是果胶网络的孔隙大小和密度。在水溶液中（自由旋转），CarboTag-BDP的荧光寿命较低；而在粘稠或结构致密的环境中，荧光寿命较高。

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