ACS Nano：纳米拓扑结构调控细胞外囊泡治疗老年骨骼肌损伤的研究

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图 1. 纳米拓扑结构促进 MPCs 的肌源性分化。

为探究纳米拓扑结构对 MPCs 功能的影响是否由 EVs 介导，作者分别使用 GW4869 （抑制 EVs 生物合成） 和 Pitstop 2 （阻断 EVs 摄取） 处理在平坦基片和纳米拓扑结构基片上培养的幼年 MPCs。结果显示，纳米拓扑结构诱导的肌管形成显著受到抑制，表现为肌管数量和长度减少 （图 2A-C） ，同时肌源性分化关键调控蛋白 MyoD 和 MyoG 的表达显著降低 （图 2D-I） ，表明 EVs 在纳米拓扑结构介导的肌生成过程中起关键作用。纳米颗粒跟踪结果显示，fEVs 和 nEVs 的平均直径约为 200 nm，且浓度无显著差异 （图 2J-K） ，说明纳米拓扑结构未影响 EVs 的物理特性。然而，拉曼光谱分析表明，fEVs 和 nEVs 的生化组成存在显著差异，nEVs 的脂质和糖类成分水平显著降低，而蛋白质和核酸含量变化较小 （图 2L-N） 。这些结果表明，纳米拓扑结构可能通过调控细胞脂质代谢及糖蛋白分布来改变 EVs 的生化组成，从而影响其功能。

图 2. 纳米拓扑结构改变 MPCs 衍生的 EVs 的生化组成。

为评估 fEVs 和 nEVs 对老年 MPCs 的直接作用，作者从 21 至 23 月龄的老年雄性小鼠后肢肌肉中分离 MPCs，并分别用 fEVs 或 nEVs 处理。免疫荧光标记结果显示，处理 4 小时后 EVs 被细胞摄取 （图 3A） 。处理 24 小时后，fEVs 显著促进了细胞增殖 （Ki-67 阳性） ，而 nEVs 和无处理对照组无显著差异 （图 3B-C） 。进一步分析显示，nEVs 处理 3 天后显著提高了老年 MPCs 的肌球蛋白重链 （ MHC） 表达，并且肌管数量、长度及成熟率显著增加；而 fEVs 处理 3 天后虽然增加了肌管数量和融合指数，但肌管普遍较小，且 MHC 表达无统计学差异 （图 3D-G） 。综上所述，fEVs 和 nEVs 在调控老年 MPCs 行为中发挥不同作用：fEVs 主要促进增殖，而 nEVs 则显著促进肌源性分化，这可能是由纳米拓扑结构诱导的 EVs 组成变化所引起的。

图 3.fEVs 和 nEVs 在调控老年 MPCs 行为中发挥不同作用。

为优化 EVs 在老年肌肉再生中的治疗策略，作者利用 3D 生物工程肌肉老化模型 （图 4A） ，系统评估了 fEVs 和 nEVs 的给药方案。图 4B 详细展示了实验设计，包括单独注射 fEVs 或 nEVs，以及两种组合策略：

1）同时注射 fEVs 和 nEVs 的混合物 （(f+n)EVs） ；

2）

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