正文
测定样品中的总氮含量
，结合蛋白的含氮特性
间接计算
其含量的方法。
该方法的原理，是因为所有的蛋白都含氮，比如某型胶原蛋白中的氮元素占总质量的约16%
(理论值，不同来源的重组胶原蛋白可能因氨基酸序列差异导致含氮量波动)
，那通过凯氏定氮法将样品中的有机氮转化为无机铵盐，再通过蒸馏、吸收和滴定等步骤测定总氮量，最终通过换算系数
(这里根据前文的16%计算为6.25，即100/16)
，由此推算出蛋白质含量。
2、凯氏定氮法的争议和不足
但目前，凯氏定氮法在化妆品或医疗器械领域的应用仍存在争议，最主要的争议来源于该方法容易
受非蛋白氮的干扰
，只要原料中有别的物质含氮，比如原料中存在游离氨基酸或肽段，就可能高估实际蛋白含量。也就是说，“理论上厂家可以往产品中加成本更低的氨基酸或肽类原料，即可通过凯氏定氮法宣称自己添加了胶原蛋白”。
在此之前，关于凯氏定氮法最大的“事故”，是奶粉届的
“三聚氰胺”
事件。
凯氏定氮法本质是化学定量分析，无法辨别氮元素来源于蛋白质还是其他化合物，所有含氮物质
(包括三聚氰胺)
均会被计入总氮量。而三聚氰胺含氮量高达66%
(远高于蛋白质的16%)
，少量添加即可显著提高“表观蛋白质含量”。这一漏洞被不法商家利用，
通过添加廉价含氮物质伪造蛋白质含量。
由于当时凯氏法是国际通用的蛋白质检测标准方法，三聚氰胺未被列为常规检测指标，且其作为化工原料未纳入食品添加剂监管范围，故此类掺杂行为长期未被发现，最终导致数万名儿童患病。直到事件爆发后，各国才紧急开发针对性检测方法，如
HPLC、LC-MS/MS。
3、大嘴博士的检测方法：HPLC
而大嘴博士采用的就是
“高精度HPLC高效液相色谱氨基酸定量法”
，大嘴博士在视频中介绍说，选择该方法是因为胶原蛋白的重要特征，即“胶原肽链中甘氨酸占氨基酸残基的1/3，
即每三个氨基酸中就有一个甘氨酸
”、“重复三肽甘氨酸-X-Y的数量接近全部序列的1/3，对维持胶原结构起重大作用”，而且“任意一个甘氨酸突变都会对胶原三股螺旋结构造成破坏”。
基于
(甘氨酸Gly-X-Y)n
的重复序列是胶原蛋白形成三螺旋结构和实现力学功能的基础。化妆品行业常见的Ⅰ、Ⅲ型
(1型、3型)
胶原蛋白均严格遵循该序列规律，而部分其他类型如Ⅳ、ⅩⅦ型
(4型、17型)
胶原蛋白等虽存在结构差异，但
核心区域
仍保留了此特征。
也就是说，只要宣称原料来源于胶原蛋白核心片段，就应该符合(Gly-X-Y)n的重复序列，则每三个氨基酸中就应该有一个是甘氨酸，所以大嘴博士选择的方法就是将胶原蛋白原料充分水解，然后测其中的各种氨基酸含量，并重点关注甘氨酸含量。而大嘴博士也正是依据该检测结果：
没有检测出甘氨酸
，从而质疑可复美产品是否完全没有添加胶原蛋白原料。
对此，接受采访的其中
一位博士分析
说：“客观来说，
小分子胶原还真不一定要有甘氨酸
，取决于选哪个片段，但是217 Da分子量有点太小了，基本上就是二肽
(一共只有400种)
，二肽很难有序列特异性，一般多肽要5肽以上才能比较接近蛋白的核心功能区。”
这相当于只选取(Gly-X-Y)序列中的“X-Y”两个氨基酸组成的二肽，因为人体必需的氨基酸一共是20种，故二肽一共就只有400种组合可能，这400种组合不需要胶原蛋白序列就可以研究，为什么要大炮打蚊子，从复杂的胶原蛋白结构中选取这400种最简单的组合？
而如果从I型胶原蛋白中截取3个或3个以上的氨基酸肽链，则不可能不带甘氨酸。查阅巨子生物的相关专利《一种高透皮吸收的I型重组胶原蛋白及其用途》，其中公开的氨基酸序列中也明确列出了甘氨酸。
不过，巨子生物表示：“没有检测到甘氨酸，需要考虑的是检测方法的有效性。217Da是一个胶原三肽，除了这个三肽之外，产品中也含有其他胶原肽。”
4、胶原蛋白检测有没有金标准？
在回答聚美丽提出的“如果请你给巨子提建议，他们可以通过怎么样的检测结果来回复，可以最大程度降低质疑”时，两位博士不约而同的提到了一种“更好的检测方法”，即
质谱检测
。
事实上，就在巨子和锦波参与编制的YY/T 1947—2025《重组胶原蛋白敷料》标准中，除了凯氏定氮法
(6.8a)
，就同步提供了液相色谱-质谱联用技术
(LC-MS/MS，6.8b)
。
“
(6.8b的)
质谱
(检测)
