基于质谱的DNA加合物组技术在药学领域应用的研究进展

中草药杂志社 · 公众号 · 药品 · 2021-04-13 06:31

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DNA 加合物较为复杂且不可预测，为更全面地测量 DNA 损伤，需要自上而下的分析方法来同时筛选已知和未知暴露以及对暴露的生物反应（如内源性亲电体的形成）产生的多种 DNA 加合物。 DNA 加合物组学（ DNA adductomics ）的概念正是基于上述背景而提出的，其不仅针对一个加合物进行测定，而是根据整体的一个特征去筛选具有共同点的一类加合物从而构成一个完整的体系，旨在检出微量水平的 DNA 加合物的基础上与生物信息学结合，实现药物致癌性监管、肿瘤早期监测及抗肿瘤药物治疗预后评估。而实现这一目标的基础是 DNA 加合物检测技术的不断改进，其中最主要的是 MS 检测仪器的不断革新。

2 DNA 加合物组学的检测方法

自 20 世纪起，国际上已建立多种 DNA 加合物分析技术 ^［ ⁵ ^］。但由于暴露后生物体内所产生的 DNA 加合物丰度极低，如何实现从大量的正常核苷酸中检测到含量极低的加合物（ 0.1 ～ 1 个加合物 /108 个核苷酸）就成为一个技术挑战。 20 世纪 80 年代建立的免疫检测法和 ³² P 后标记分析法是最早应用于人类基因组检测并发现 DNA 损伤的技术。此外，液相色谱（ liquidchromatography ， LC ） - 吸收 / 荧光光谱法和 LC- 电化学检测也较为常用。然而，这些技术多为间接或非定量的方法，无法提供有关加合物结构的信息。

LC 与电喷雾电离（ electrospray ionization ， ESI ）耦合成为近年来一项突破性的技术，该方法能够同时检测多种 DNA 加合物 ^［ ⁷ ^］。电子冲击气相色谱法用于测定 DNA 加合物，特别是氧化的 DNA 碱基，而 MS 裂解谱可用于证实其加合物的结构，并且这种方法随着仪器灵敏度的提高，检测灵敏度可至 1/1 010 个核苷酸（ nucleotides ）。这种选择性高、特异性强、且能提供加合物结构信息的特点使得液相色谱 - 质谱法（ LC-MS ）有望取代 ³² P 后标记法成为 DNA 加合物筛选的首选方法。

3 应用加合物组学的 MS 仪及方法

近年来，新兴的加合物组学技术是 LC-MS 方法的延伸，可用于筛选已知或未知的 DNA 加合物，同时监测多种加合物与碱基突变之间的关联。随着 MS 方法和 MS 仪器的不断改进，衍生出了各种不同功能的质谱仪，并在检测加合物的应用上发挥了巨大作用。

3.1 MS 仪

在加合物组学应用的 MS 仪主要有三重四极杆质谱仪（ triplequadrupole mass spectrometry ， QqQ-MS ）和离子阱质谱仪（ iontrap-MS ）。

3.1.1 QqQ-MS QqQ-MS 由 3 个对齐的四极组成，其中第 1 个四极（ Q1 ）和第 3 个四极（ Q3 ）进行离子选择，中间四极子（ q ）作为碰撞单元，实现波束型碰撞诱导解离（ collision-induceddissociation ， CID ）碎片化。 QqQ-MS 有 4 种基本的串联扫描模式：选择性反应监测（ selected reaction monitoring ， SRM ）、碎片离子扫描、前体离子扫描和中性缺失扫描（ constant neutral loss ， CNL ） ^［ ⁸ ^］。 SRM 模式下的 QqQ-MS 用于小分子的定向测量，包括 DNA 加合物。而中性缺失扫描（ constant neutral loss ， CNL ）是一种经过修改的 SRM 模式。 Wolf 等 ^［ ⁹ ^］于 1994 年首次使用 CNL 筛选 N - 乙酰氧基 - N - 乙酰基 -2- 氨基芴与小牛胸腺 DNA 结合形成的加合物。使用三重四极杆仪器和毛细管色谱的 CNL 方法检出 3 种存在于熟肉的致癌物 2- 氨基 -1- 甲基 -6- 苯基咪唑的 DNA 加合物 ^［ ¹⁰ ^］。 QqQ-MS 因其高灵敏度和高选择性而被广泛应用，具有动态范围宽、工作周期快、运行稳定性好等优点 ^［ ¹¹ ^］。

3.1.2 ion trap-MS 离子阱是一种通过振荡电场 “ 捕获 ” 离子的装置，根据不同的结构，它可以将离子存储在三维空间中：称为四极离子阱（ quadrupole ion trap ， QIT ），也可以存储在二维空间中：称为线性离子阱（ linear ion trap ， LIT ）。与 QIT 相比， LIT 具有更高的存储容量和捕获效率 ^［ ¹² ^］。离子阱已被用于许多生物分析应用，包括药物代谢产物的表征 ^［ ¹³ ^］、寡核苷酸测序 ^［ ¹⁴ ^］和蛋白质修饰的鉴定 ^［ ¹⁵ ^］。 Turesk 实验室率先在 LIT 中筛选了不同种类基因毒物的多种 DNA 加合物 ^［ ¹⁶ ^］。 LIT 也用于检测抗癌药物 acylfulvene 和隐陡头菌素 S （ illudin S ）在治疗的结肠癌细胞系中诱导的 DNA 加合物 ^［ ¹⁷ ^］。

3.2 质谱方法

在加合物组学应用的 MS 方法主要有四极杆离子阱质谱（ Q-trapMS ）、四极杆飞行时间串联质谱（ quadrupole-timeof flight-mass spectrometry ， Q-TOF-MS ）和四极杆离子阱组合质谱和线性离子阱组合质谱（ quadrupole and LIT-hybrid orbitrap MS ）。

3.2.1 Q-trap MS Q-trap MS 是一种混合的 QqQ-MS 方法，具有 QqQ-MS 的所有标准扫描功能和 LIT 代替 Q3 所带来的额外扫描功能。在 Q-trap MS 中， LIT 可以用作标准 Q 或用作产生 MS ³ 光谱的附加破碎装置或存储来自碰撞细胞的碎片离子（ q ），以提高产物离子光谱的质量和被测碎片的质量准确性（ theenhanced product ion scan ， EPI ） ^［ ¹⁸ ^］。 Feng 等 ^［