消岩汤对肺腺癌A549实体荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡干预机制的研究

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Lipofectamine 2000 转染试剂购自 Promega 公司， siRNA 片段由上海生工生物工程股份有限公司合成提供。

1.4 仪器

LD4-2 台式离心机，北京医用离心机厂； EA2004 电子天平，上海天平仪器厂；超净工作台，苏州净化设备公司；倒置显微镜，日本 Nikon ；恒温水浴箱，北京医疗设备厂； 722 紫外可见分光光度计，上海分析仪器厂； C-2021CO ₂ 孵育箱， TyTe 公司； yxQG02 内热蒸汽消毒器，山东新华医疗器械厂； M200 酶标仪， TECAN 公司（芬兰）； 96 孔板， Greinerbio-one 公司；流式细胞仪，美国 BECKMAN-COULTER （贝克曼 - 库尔特）公司。

2 方法

2.1 消岩汤含药血清的制备

健康 BalB/C 小鼠，分为 2 组，每组 20 只，分为对照组和消岩汤组，消岩汤的剂量均以生药量计，根据前期进行的急性毒性实验结果，消岩汤的最大给药剂量为 304 g/kg ，相当于成人临床推荐日用量的 130 倍，未出现明显毒副作用。前期研究表明，消岩汤按 40 g/kg （为临床成人日用量的 20 倍） ig 给药对顺铂诱导的 A549/DDP 耐药细胞的凋亡具有显著的增强作用 ^[2] 。故本研究以消岩汤按 40 g/kg （为临床成人日用量的 20 倍） ig 给药；对照组 ig 0.4 mL 生理盐水。每次给药间隔 24 h ，连续 14 d 。末次给药后禁食、禁水 12 h ，眼眶取血法采血，无菌分离血清，经 56 ℃， 30 min 灭活处理后，用 0.22 μm 微孔滤膜滤过除菌，置 −20 ℃保存空白血清和消岩汤含药血清。

2.2  siRNA 转染 A549 细胞的制备

在 Invitrogen 公司的网上设计系统（ http://www. invitrogen.com ）中设计的靶向 Survivin 基因的 siRNA 序列：正向引物 CTGAGAACGAGCCAG- ACTT ，反向引物 AAGTCTGGCTCGTTCTCAG 。 按照说明书稀释退火形成双链 dsRNA ，所涉及序列经 BLAST 查询，排除其他基因同源性。将对数生长期的 A549 细胞接种于 6 孔板中，待细胞贴壁生长至 80% 融合时，磷酸盐缓冲溶液清洗 1 次，更换无血清培养基，按照 Lipofectamine 2000 转染试剂说明书进行转染 48 h ^[5] 。

2.3 实验动物分组

通过 SAS 软件得出随机数字，按 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 ，将小鼠分为模型组、消岩汤组、 siRNA 转染组、消岩汤＋ siRNA 转染组，共 4 组，每组 10 只裸鼠，饲养在 SPF 级屏障系统内设 IVC 环境内， 5 只动物同一塑料盒中，给予 SPF 级动物专用料块，自由饮用蒸馏水。饲养室温度（ 20 ± 5 ）℃、日温差≤ 3 ℃，相对湿度 40% ～ 60% 、光照 12 h 明暗交替，空气洁 净度为 100 级，氨质量浓度≤ 14 mg/m ³ ，噪声≤ 60 分贝，工作照度为 150 ～ 300 lx ，动物照度为 100 ～ 200 lx

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