正文
细胞产品通常为分离、纯化后的细胞，一般直接取样进行样本处理即可。取样时需关注所取样品的代表性、取样时样品的均匀度等，避免取样带来的检测数据偏差。由于细胞产品的待检样品均为活细胞，如不能立即检测，需在方法建立之初对取样后待检样品的贮存条件如暂存时间、温度、光照以及运输条件
（如运输距离、运输温度、振摇情况）
等敏感因素进行考察，评估样本的稳定性，以保证检测数据的准确性和可靠性。同时研究人员在进行流式分析时还应关注不同批次样品中细胞碎片和死细胞的影响，避免因样品质量差异导致检测数据的偏差。由于细胞治疗产品起始原材料中潜在的病原微生物风险，对于流式实验人员的防护、实验室环境和设备的清洁、废弃物的处理等，均需要符合生物安全的相关规定。
荧光偶联抗体是流式检测中的关键试剂之一。不同细胞产品在流式配色的设计上有所不同，研究者一般会结合样品来源、产品设计、目标标志物的表达情况以及设备配置情况等进行目标细胞群的染色设计。在临床外周血检测中，一般使用多色方案进行淋巴细胞亚群分析，如在淋巴细胞亚群检测中，可采用 CD45 和/或 CD3 作为设门抗体，并利用 CD4，CD8，CD16 和 CD56 等单抗特异性标记淋巴细胞某一亚群。在细胞治疗产品中，除了放行检测的少量关键指标外，流式分析还应该补充使用其他检测组
（panel）
进行更进一步非放行目的的表型和功能分析
（如趋化因子受体、激活或衰老标记物、细胞内因子等）
，这些补充研究在确定产品更广泛的表型和功能方面非常有用，也可能是产品未来变更中重要的预判指标。
对于荧光偶联抗体的选择，应结合产品特性和检测方法，将有文献报道、权威网站已提供信息或产品说明书中有验证信息的克隆株作为首选，其他的免疫分析技术，如酶联免疫吸附分析、免疫印迹等，也可帮助评估抗体试剂的特异性。同时需关注其来源、克隆、荧光染料等信息。来源不同的抗体，如鼠抗、兔抗等，其非特异性结合情况可能不同。对于常用的免疫细胞表型分析来说，即使是相同的分化抗原
（cluster of differentiation，CD）
抗体，不同的克隆其抗原结合特性也可能不同。同样，同一 CD 抗体，使用不同荧光染料标记，其荧光强度和可能存在的荧光重叠也可能不同。多色荧光分析时，实验室不仅要验证每一种单抗的性能，还需要证实其性能不会受抗原封闭处理、荧光淬灭或荧光能量转移的影响。一般抗体单独使用和作为组合成分使用时，检测结果
（包括平均荧光强度和阳性率）
之间的变化幅度不得超出 2 倍标准差范围。对于研究周期长、批次多的项目，荧光偶联抗体批次间差异的影响也需要予以充分评估。
荧光抗体的用量和孵育条件也是流式检测的关键参数。对于市售荧光抗体，试剂生产商一般会建议相应的抗体用量和孵育条件，实际使用中一般会以实际样品进行抗体用量的优化，确保达到最优的抗体/细胞用量比。对于染色温度、时间也应基于不同产品进行优化以确定最佳方法参数。
除了荧光抗体，对于流式细胞术使用的其他试剂，都需充分评估其非特异性结合情况，必要时可使用 Fc 受体作为阻断剂。
细胞治疗产品在开发周期内，随着新的、更优的商业化试剂的出现，存在流式检测抗体进行变更的情况。方法发生变更后应及时开展方法桥接研究，明确变更对于检测数据的影响，以确认历史批次数 据是否可桥接。不能桥接的数据应考虑变更后方法的数据量是否足够支持产品质量标准的拟定。自体细胞产品方法桥接时应考虑个体差异的影响，对研究使用细胞批次数的合理性应进行说明。
在流式的多参数分析中，门是最为重要的概念之一。对于研究周期长、批次多的项目，荧光偶联抗体批次间差异的影响也需要予以充分评估。对于重要的参数，流式数据一般以散点图、直方图和等高线图的形式呈现，分析人员可选择不同的呈现方式以帮助正确设门。当细胞表面标志物区分非常明显时，细胞群边界较容易区分，如淋巴细胞亚群分析中 CD3，CD4 和 CD8 阳性细胞独立成像。当细胞群较难区分时，设门就会非常具有挑战性，在不同的情况下可能会额外增加阳性和阴性对照、荧光减一对照
（fluorescence minus one，FMO）
、同型对照
（isotype control）
、同克隆对照
（isoclonie.control）
等。门控策略直接影响流式分析的结果，即使是同一个采集数据，在不同实验人员进行设门处理后得到的结果也很难完全一致。因此，在良好实验规范
（Good Laboratory Practice，GLP）
实验室中，建议在开发过程中尽可能定义并标准化门控策略和分析模板，以减小数据的可变性。同时采用如规定最小或最大门控边界、采用对照等策略，既能给予操作人员一定的灵活性又可以防止有意识或无意识的数据操作，该要求对于药物研发实验室也可借鉴。对于细胞治疗产品，流式分析的门控策略应作为方法标准操作规范的重要内容，在实验人员培训、方法转移等过程中进行详细的培训和说明。避免出现同一方法因不同操作人员或不同场地之间的门控策略差异而造成数据偏差，从而影响临床给药剂量等关键指标。
