Nature Methods | 长读长测序“去伪存真”：SAVANA如何颠覆癌症基因组分析的传统认...

正文

请到「今天看啥」查看全文

在没有正常细胞浸润的肿瘤中，失去杂合性（loss of heterozygosity, LOH）区域的B等位基因频率应为0或1，而正常细胞的浸润会导致BAF值向0.5偏移，偏移程度与正常浸润程度成比例。这种巧妙的算法设计，使得SAVANA能够通过分析患者特异性的杂合SNPs或群体多态性SNPs来推断肿瘤纯度。

为了进一步提高灵敏度，SAVANA还会利用拷贝数信息来“挽救”那些由于读段比对阈值未达标而未能被判定的断点。如果这些断点与拷贝数变化点（copy number changepoints）一致，它们将被重新纳入考量。最后，SAVANA会根据估算的肿瘤纯度，确定最能解释观察到的测序读段深度和BAF数据的肿瘤倍性（ploidy）和等位基因特异性拷贝数（allele-specific copy number）图谱。

值得一提的是，SAVANA还引入了蒙德里安共形预测（Mondrian conformal prediction, MCP）这一数学上严谨的方法来评估每个SV调用的可靠性。与传统质量分数（quality scores）不同，MCP能提供数学保证，确保预测结果的错误率不会超过预设的阈值，即使在处理高度不平衡的数据集（如真实体细胞SV是少数类别）时也能保持高可靠性。MCP将预测结果分为四类：“真阳性”（somatic SV）、“噪音”（noisy region prone to artifacts or germline SV）、“空”（null）和“两者皆是”（both）。“空”类别表示模型认为该SV与训练数据差异过大，无法做出可靠预测，可能是一个离群值。“两者皆是”类别则表示该SV与训练数据中的真实SV和噪音事件都相似，模型无法做出单一决策。这种透明且可靠的预测，为科学家们提供了前所未有的信心。

严苛考验：SAVANA的“硬核”训练营

一项优秀的算法，离不开严谨的测试和高质量的数据。为了全面评估SAVANA的性能并建立一套公正的基准测试标准，研究团队进行了一系列大规模的实验，其严谨程度堪称算法的“硬核训练营”。

大规模数据集：绘制人类肿瘤基因组的广阔图景

这项研究的严谨性，首先体现在其庞大的样本量和高质量的数据集上。研究团队对99个肿瘤-正常配对样本进行了深度测序，其中包括57例多样化的软组织肉瘤、28例骨肉瘤和14例胶质母细胞瘤。这些样本的DNA分别通过长读长纳米孔全基因组测序（nanopore WGS）和短读长Illumina全基因组测序进行。

具体来说，肿瘤样本的纳米孔测序中位深度达到了51倍，正常样本为34倍；而Illumina测序的肿瘤样本中位深度高达118倍，正常样本为41倍。在长读长数据质量方面，肿瘤和正常纳米孔测序读段的中位N50（表示一半测序碱基长度所对应的最短读段长度）分别达到了15千碱基对（kbp）和21 kbp。经过严格的质量控制，最终有92个肿瘤样本被纳入了后续的深入分析。这种大规模、多平台、高质量的数据集，为SAVANA的训练和验证提供了坚实的基础。

构建“真理”数据集：机器如何学习区分真伪？

为了给机器学习模型提供高质量的“训练数据”，从而使其能够区分真实体细胞结构变异（“真阳性”）和测序或比对错误导致的“伪影”（“假阳性”），研究团队首先利用临床级别的短读长全基因组测序数据，作为识别SV的“金标准”。具体做法是，如果SAVANA在长读长数据中检测到的SV，同时也被短读长数据分析管线（经过临床验证）所检测到，那么该SV就被标记为“真实体细胞SV”。反之，如果长读长数据中检测到的SV未在短读长数据中被发现，则被标记为“假阳性”。

在这样的标注体系下，SAVANA在长读长数据中，共检测到约52,464个被确认为真实体细胞SV的事件，而同时也有高达14,282,014个事件被标记为假阳性。为了避免将那些只在长读长测序中才能检测到的、但实际存在的真阳性SV误判为假阳性，研究团队在构建训练集时，特别排除了那些在长读长数据中具有高支持质量，但在短读长数据中未被发现的SV。这种严谨的策略，确保了训练集的纯度。

随后，研究团队采用了“留一肿瘤交叉验证”（leave-one-tumor-out）的方法，利用随机森林（random forest, RF）分类器训练模型。这意味着，在对某个特定肿瘤进行SV分类时，模型会使用队列中所有其他肿瘤的SV数据进行训练。这种训练方式有效地评估了SAVANA模型在不同肿瘤类型之间的泛化能力。结果显示，RF模型的性能表现出色，平均曲线下面积（AUC）高达0.98，范围介于0.97-0.98之间，这表明模型具有很高的区分能力。

那么，哪些特征对于模型区分真伪最具预测性呢？研究发现，最重要的协变量包括： 肿瘤样本和匹配正常样本中支持性比对（supporting alignments）的数量、SV的长度、支持断点的未定相（unphased）比对数量，以及在正常样本中支持任意断点方向的读段簇数量 。这些生物学和测序特性的巧妙结合，使得SAVANA的机器学习模型能够高效地学习和识别真正的体细胞SV。

如前所述，SAVANA还引入了蒙德里安共形预测（MCP）来评估个体预测的可靠性。与仅仅提供一个质量分数不同，MCP能够数学上保证预测错误率不会超过用户设定的阈值，这对于处理高度不平衡的数据集（如真实体细胞SV是少数类别）尤其重要。它不仅提高了模型性能，也为临床应用提供了更可信的判断依据。

巅峰对决：SAVANA力压群雄的性能秘密

在确定了SAVANA的训练方法和数据基础后，真正的“巅峰对决”开始了。研究团队将SAVANA与现有专门用于长读长数据SV检测的算法进行了全面比较，包括Sniffles2、cuteSV、SVIM等广受使用的工具，以及NanomonSV、Severus和SVision-pro等为匹配肿瘤-正常数据设计的算法。结果表明，SAVANA在多方面展现出压倒性性优势。

真理的较量——COLO829细胞系

在第一轮测试中，研究团队使用了黑色素瘤细胞系COLO829及其匹配的正常细胞系COLO829BL的数据集，该数据集拥有经过PCR和捕获测序验证的68个体细胞SV作为“真理集”。结果清晰地显示，与现有算法相比，SAVANA在长读长测序平台和流式细胞版本上均展现出显著更高的召回率（recall）和特异性（specificity），其P值远小于0.0001。这意味着SAVANA不仅能更全面地发现真实的SV，还能显著减少误报的假阳性。

复制实验——揭示算法的“稳定性”与“假阳性陷阱”

为了更全面、无偏地评估算法性能，研究团队创新性地引入了“复制实验”策略。其核心思想是：将每个肿瘤样本的测序读段随机分成两个独立的二进制比对映射（BAM）文件，形成两个“模拟复制品”，然后分别对每个复制品独立运行SV检测算法。理论上，真实的体细胞SV应该在所有复制品中都被检测到，而由文库制备或测序错误导致的假阳性则只会在一个复制品中出现。这种方法不仅能够有效评估算法的灵敏度（sensitivity）和特异性，还能避免因测序产量不均等因素对结果造成干扰。

通过这种严苛的复制实验，研究团队发现，现有算法检测到的体细胞SV数量差异巨大，最高可达两个数量级。例如，某些算法在一个复制品中检测到的体细胞SV数量变化高达两个数量级。相比之下，SAVANA在不同肿瘤类型中，跨复制实验的一致性显著更高，P值小于0.001。无论是在不同肿瘤类型、不同克隆水平（clonality levels）、各种SV类型还是重复序列类别中，SAVANA都展现出更高且更均匀的一致性。这种在低等位基因频率（low-AF）范围内的较高一致性，有力地证明了SAVANA同时具备更高的特异性（specificity）和灵敏度。

请到「今天看啥」查看全文