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但是，蛇的腿为什么会退化呢？最近，一些分子生物学家找到了另外的答案。为了弄明白蛇的四肢退化原因，美国劳伦斯伯克利国家实验室阿卡索·维瑟尔
（Axel Visel）
教授领导的研究小组将目光聚焦在一个叫音猬基因
（Sonic hedgehog gene）
的远距离增强子ZRS上。
音猬基因是胚胎发育一种非常重要的基因，对胚胎体节发育和肢芽形成起着重要作用。音猬基因首先在果蝇身上被发现，因该基因突变的果蝇胚胎呈多毛团状，酷似受惊刺猬而得名，几乎存在于所有动物和人。而ZRS增强子位于音猬基因的上游约100万个碱基对的位置，对脊椎动物四肢发育至关重要。一旦这个增强子序列发生突变，可能导致动物的四肢发育异常，其中一些突变导致了人的多指症。
研究人员分析了6种蛇类的ZRS增强子序列，包括缅甸蟒蛇、红尾蚺、扁颈眼镜蛇、斑点响尾蛇、极北蝰和玉米蛇，分别代表蛇类进化过程中的不同形态阶段，其中前两种蛇还保留有后肢残迹，后四种蛇的四肢则完全退化。在将这些序列与人、小鼠、牛、海豚、象鼻鲨、鸡、蝙蝠、蜥蜴和腔棘鱼等其它16个物种的同源序列进行比对后，研究人员惊奇地发现这6种代表性蛇类的ZRS增强子均缺失了一段17个碱基对序列，其中玉米蛇的ZRS增强子序列则全部缺失，这也是ZRS增强子区域内唯一的一段在所有蛇类全部缺失，而在蜥蜴和鱼类等其它物种中都高度保守的序列，因此推测其与蛇的四肢退化有关。
为了进一步研究这些增强子ZRS缺失序列的功能，维瑟尔教授研究小组利用CRISPR/Cas9这一最新的基因组编辑技术，将小鼠增强子ZRS序列替换成其它物种的同源序列，包括人和腔棘鱼的序列。在这些基因序列被替换的小鼠胚胎中，研究人员观察到，替换成眼镜蛇ZRS序列的小鼠完全检测不到音猬基因的表达，蟒蛇ZRS序列替换小鼠则只有极其微弱的表达，但是这些小鼠的四肢均显著缩短，而且成年后四肢也没有能长出，而其它物种的ZRS序列均没有影响小鼠的四肢发育，就连本身不长腿的海豚、鲨鱼和腔棘鱼等鱼类ZRS序列也没有蛇类ZRS序列的威力，序列替换后小鼠的四肢也发育正常。
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被蛇的增强子ZRS序列替换后，小鼠四肢发育不全（EZ Kvon et al., 2016)
显然，缺失17个碱基对序列的音猬基因增强子ZRS越来越像是蛇类四肢退化的“罪魁祸首”了，这一进化史上的悬案似乎结案了，但是维瑟尔教授研究小组研究得正起劲，完全没有停下来的意思，很快，他们又将这一段缺失序列补回到蟒蛇的增强子ZRS上，同样采用CRISPR/Cas9技术，将该重构的蟒蛇ZRS序列替换掉小鼠的同源序列，结果小鼠的四肢发育完全正常，进一步证实了蛇类音猬基因增强子ZRS的17个碱基对序列缺失是蛇类四肢退化的主要原因。
不过维瑟尔教授研究小组让小鼠来验证增强子ZRS的功能并非首创，应该是受日本科学家的启发。早在2005年，日本国家遗传学研究所Tomoko Sagai等人将小鼠的音猬基因增强子ZRS全部删除，得到的小鼠四肢也大大缩短，第一次利用基因工程小鼠模型证明了增强子ZRS对动物四肢发育至关重要的作用。维瑟尔教授研究小组发现完全缺失增强子ZRS序列的玉米蛇也正与这一研究结果相吻合。
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ZRS序列删除的小鼠四肢也表现出发育不全（Tomoko Sagai et al., 2005)
也可能有人会脑洞大开，如果用蜥蜴的ZRS序列将蛇的同源序列替换掉，会不会培育出拥有四只脚的蛇呢？正如维瑟尔教授研究小组2016年10月20日在美国《细胞》杂志上论文所声称的那样，他们并不希望制造出这种四脚蛇，而且可能还存在其它的基因或调控序列对动物四肢的发育起到一些重要作用。
几乎就在维瑟尔教授研究小组发表论文的同时，美国霍华德·休斯医学研究所的弗朗西丝卡·利尔
（Francisca Leal）
和马丁·科恩
（Martin Cohn）
也在《当代生物学》
（
Current Biology
）
发表论文，公布了他们所发现的蟒蛇后肢并没有完全退化的秘密，同样也涉及音猬基因调控四肢发育的特异增强子ZRS突变，除了维瑟尔教授研究小组发现的那个缺失片段，他们还发现了该增强子的另外两段缺失序列都可能也与蟒蛇后肢并没有完全退化有关，而这三段缺失的序列共同作用，使得蟒蛇的ZRS增强效应减弱了近90%。他们进一步的研究认为，这三段缺失的序列原本正好是音猬基因一些转录因子的结合位点，蟒蛇的序列缺失让这些转录因子无法正常工作，使得音猬基因表达水平大幅减弱，最终导致蟒蛇前肢完全退化，后肢部分退化。
