正文
在测试诸如SARS-Cov-2这类新病毒时,第一波诊断几乎全都依赖于两项尽管不是十分现代但却非常重要的技术。
第一个技术叫做聚合酶链式反应(PCR),它是一项DNA扩增技术,通常在实验室中使用,可在短时间内扩增目标DNA,以便对其进行分析研究。
凯利·穆利斯(Kary Mullis)在1983年发明聚合酶链式反应,利用加热和冷却循环,大量复制样本稀少的DNA。
穆利斯因此获得1993年诺贝尔化学奖。
再结合可标记DNA的荧光染色剂,PCR可以让科学家知道具体的DNA数量。
PCR技术可以用来有效判断病原体的存在(无论是在宿主体内还是遗留在物体表面)。
但是,由于SARS-CoV-2这类病毒的基因组为单链RNA构成,因此科学家在检测之前,需要先把病毒的基因组转变为双链的DNA。这时候,他们就需要逆转录酶来帮忙。将这两个技术组合在一起,就是逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。
当前,RT-PCR是检测一个人是否感染新冠病毒的唯一方法。其他检测方法均无法区分新冠病毒与流感病毒,更无法区分新冠病毒与其他十几种在每年这个时候引起呼吸道疾病的病毒。明尼苏达大学分子病毒学研究所主管路易斯·曼斯基(Louis Mansky)说:“(RT-PCR)是微生物实验室中普遍使用的一项标准且可靠的技术,它可以迅速应用于临床测试,大概也是开发起来最快的检测方法。”
但问题是,在其他检测方法得到开发并获得批准之前,所有新冠病毒的检测都只能在实验室里由受过专门训练的技术人员进行操作。
检测需要PCR设备以及经过培训的设备操作员,这意味着新冠病毒检测无法在诊所或患者家中进行。但曼斯基也说,由于PCR在生物学界的地位举足轻重,因此很多大学和医院的研究实验室都配备了必要的设备和人员。只是在美国,只有经过联邦医疗保险和医疗补助服务中心认证的实验室,才能处理临床样本。而这个所谓的认证过程,耗时数月。Kalorama Information是一家专门研究医疗诊断的市场研究公司。该公司的出版负责人布鲁斯·卡尔森(Bruce Carlson)说:“我们对医疗检测有着十分繁琐的监管体系,既担心错报,又担心漏报。”
试剂齐全的话,基本上一天就可以出结果。但是试剂短缺和运输物流会导致一次检测需要数天乃至数周才出结果。(事实上,这个问题已经存在,我们稍后会详述。)下面,让我们来捋一遍正常的流程:
第一步,收集样本。医护人员用无菌拭子擦拭患者鼻腔或喉咙后部,目的是采集从之前在肺部停留过的物质。目前,普遍认为,病毒在肺部进行复制。采集完成后,拭子被密封起来,装在冷藏容器内,送往检测实验室。样本的储存温度必须保持在1.7℃至4.4℃之间。另外,如果样本采集后四天内未进行处理,就需要把样本放进冷冻柜或做废弃处理。
样本送到实验室后,第一步要做的是从样本中分离出RNA。样本中的其他物质——人体细胞、蛋白质、酶等会破坏病毒的基因密码。这一步叫做RNA提取。手动提取RNA需要添加化学物质,然后用离心分离法析出RNA。一些大型的生化供应商会提供试剂盒,里面有RNA分离所需的一切。也有自动化机器可以完成RNA分离。
RNA分离出来后,就是往里边加入逆转录酶,把单链的RNA变成双链的DNA。再接下来,把处理好之后的DNA,连同核苷酸、DNA聚合酶和一小段DNA合成片段(即“引物”)一起,放入试管。这些引物的作用是发现并结合病毒基因组的特定片段。简言之,如果一切正常的话,它们应该只会识别和扩增病毒的基因物质,而无视样本中的其他一切“杂质”,比如人类或细菌的DNA。
这一切都在PCR仪器内完整。PCR仪器可以控制温度循环。对试管加热时,DNA的双螺旋结构分裂成两条单链,每条单链的一侧暴露在外。随后,对试管进行降温,这时引物配对到单链裸露在外的一侧。然后,DNA聚合酶利用引物作为DNA复制的起始点,根据单链的结构开始构建互补链。五分钟后,一条完整的DNA双链就复制好了。经过30到40次循环,一个DNA结构可以扩增至数百万个,足够科学家对其进行检测。
检测过程是这样的:在PCR扩增阶段,科学家会往试管里加入荧光染色剂。这些染色剂只会在遇到DNA时发光发亮,可以很好地用来标记DNA。随着DNA数量的增加,荧光强度也随之上升。PCR仪器内部的特殊光测量仪可以读取这些荧光图,从而判断哪些样本中有病毒,哪些没有病毒。“如果某一份样本里有冠状病毒,那么它的RNA就会被转录成DNA,进而复制扩增,最后荧光信号会告诉我们检测结果是阳性还是阴性,”曼斯基说。
关于RT-PCR,比较重要的一点是,它不是针对某一种病毒的一项测试;
而是一种用来识别特定基因序列的方法,广泛应用于全球的学术、商业和公共卫生实验室。
并且,科学家用来获得可靠结果的具体“配方”——使用哪一种RNA提取试剂盒、哪一台PCR仪器以及哪些引物——也各有不同。
这些具体的“配方”,我们称之为“协议”。
当有新的疾病——比如这一次的新冠病毒疾病——出现时,大学、国家研究机构和公共卫生组织(如国家疾控中心等)等往往会在第一时间制定出RT-PCR协议。
他们拥有生物安全实验室,可以处理致命的新型病原体(包括培养病原体的能力),这是验证各种检测有效性的关键一步。
一旦机构有了初步检测,他们就可以把检测下放到当地的公共卫生实验室和医院。
最终,如果疫情持续扩散,商业实验室和诊断公司也会生产他们自己的检测试剂盒。
从今年1月份开始,中国研究人员率先发布了SARS-CoV-2的第一个全基因组序列。
此后不久,世界各地的组织陆续开始设计、测试和公布用过检测新型冠状病毒的RT-PCR协议。