正文
但是，重组蛋白的过表达，可能导致胞内聚集，降低产率。在胞内发生的翻译后修饰，常产生不必要的高甘露糖基化，导致注射到人体后在血流中被快速清除。为了克服这些缺点，Nasab等将编码甘露糖基转移酶的基因敲除，生成ALG3/ALG11双敲除的酿酒酵母菌株，防止表达蛋白的高甘露糖基化。
毕赤酵母
甲醇营养型毕赤酵母是一个成熟的表达重组蛋白的工业化宿主，主要用于各种酶和治疗性蛋白的商业化生产。四十多年前，菲利浦石油公司（Phillips Petroleum）将它引入单细胞蛋白（SCP）的商业化生产中，生产动物饲料添加剂。1980年代后期，由于采用了强效且严谨调控的乙醇氧化酶（AOX1）启动子，毕赤酵母被开发成重组蛋白表达宿主。这个系统生产的重组蛋白有胞外分泌和胞内表达两种形式。毕赤酵母在发酵培养时能达到非常高的细胞密度，产生大量的目的蛋白。强效且严谨调控的启动子是保证蛋白高表达的主要因素之一。1990年代，毕赤酵母首次用于工业化生产衍生于植物的醇腈酶，在培养上清中的表达量超过20g/L。毕赤酵母表达系统与其他表达系统相比有几个优势（图2）：（1）能进行某些翻译后修饰的高表达宿主，（2）在成分明确的培养基中易于生长，可达非常高的细胞密度，（3）发酵规模易于放大，（4）具成本效益的工艺和产品开发，比处理哺乳动物细胞便宜。
哺乳动物细胞最常用于生产重组治疗性蛋白，因为它产生的蛋白更接近人的蛋白。与微生物相比，哺乳动物细胞需要丰富的培养基和补料才能生长，生长条件严苛，培养周期长。向哺乳动物系统中引入基因和克隆开发较微生物系统繁琐。几种转染方法被开发出来，尝试高效率地导入基因和生成库。最近开发的、无需连接酶的克隆和筛选技术可以更有效地克隆和表达目的蛋白。但是，仍需要对细胞系做些修饰，提高表达率和产品质量。。
创新的平台技术可以在研究开发阶段以及后续的生产中整合进去。与重组蛋白生产相关的平台技术主要用于开发和优化上游和下游处理。这些技术应用于细胞系开发、克隆筛选和选择、培养基和补料优化、工艺优化、上游端的细胞去除方法、下游端的各个纯化步骤优化。
对微生物系统的发酵工艺，需要分析消耗的培养基，给出培养上清中消耗的和积累的成分的准确信息。然后，基于对消耗培养基的分析数据，优化培养基补料和生物反应器参数。碳源是培养
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和酵母的主要培养基组分，不同的种类有可能显著影响细胞代谢、蛋白的产量与质量。
在开发早期，克隆筛选、培养基和补料筛选、确定工艺参数仍然是挑战。但是，由于出现了高通量的筛选设备，如微型生物反应器，现在所有的筛选工作都变得容易了，包括在很小规模上进行工艺优化。为了建立大规模重组蛋白生产工艺，采用这类先进的微型生物反应器系统进行发酵工艺开发，能节约时间和费用。
最近，M2p实验室开发了另一种叫做BioLector的小型生物反应器。这个平台包含48个微型生物反应器，用于高通量发酵，同时还能在线监测工艺参数，如生物量、pH、DO、荧光等。BioLector采用非侵入性的光学传感器进行微量板操作。而且，转速、温度和湿度都能控制。这个平台适用于需氧和厌氧培养。迄今为止，这个系统已被用于多种微生物的培养和工艺开发，如
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、枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、毕赤酵母、汉逊酵母、酿酒酵母、链霉菌、青霉菌、四膜虫、Sf9/SF21和烟草等。
Biolector系统应用非常广泛，比如，细胞系和细胞株筛选，培养基和补料筛选，发酵工艺参数优化，合成和系统生物学，厌氧和微需氧发酵，增殖、表征、蛋白动力学研究，高通量蛋白表达，酶和细胞活力测试，蛋白组学研究和质量控制等。
在早期开发阶段应用高通量筛选设备，非常有助于降低生产过程的时间压力，这些设备能在很小的规模、使用最少的资源，进行大量的克隆和工艺筛选实验。例如，HTP设备AMBR （Advanced micro-bioreactor）可在10-15mL规模进行细胞系筛选、培养基补料筛选和工艺优化。
此外，为了有效开发生产工艺，强烈建议将QbD概念与高通量方法或DoE应用于上游、下游以及分析过程。QbD方法已用于开发更有效的重组蛋白生产工艺，包括增强临床疗效的mAb。Horvath等介绍了一种基于QbD的USP优化（图1）。Harms和Abu-Absi等对上游细胞培养和发酵工艺的设计空间进行研究并发表了论文。Jiang等发表了运用QbD原理在疏水层析（HIC）中的重要发现，Pathak、Michels等分别发表了QbD在开发mAb聚集和分子大小异质性分析方法中的运用。
上游工艺开发和工艺调整包括方法研究和优化。USP包括许多部分，如细胞系工程和稳定细胞系开发，高表达克隆筛选，培养基和补料筛选，从小规模向生产规模放大的工艺开发。此外，生物反应器结构和设计，细胞澄清方法，工艺控制和分析方法都是工艺优化的组成部分。全面的工艺优化最终收获高滴度、高得率和期望的产品质量。
在三种表达系统中，
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相对简单，因为其易于处理，基本的营养需求，易于遗传操作，包括基因克隆和细胞工程、信号转导，发酵工艺开发简单。但是，纯化工艺比较繁琐，因为其缺少翻译后修饰机制，因而最终收获率低于另两种系统。目的基因很容易插入到细菌质粒中，转化细菌后，在抗生素选择下，在宿主中扩增。几天内就可以完成基因克隆，构建一个新的质粒，进行蛋白表达研究。目前，有多种商业化（如Novagen）的细菌表达质粒和修饰的
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宿主可用于基因克隆和蛋白表达研究，并用于工业化蛋白生产。
这些质粒最大的不同之处在于抗生素选择标记、基因诱导方法、是否有信号序列和修饰的表达细胞系（如蛋白酶缺陷的
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BL21DE3），有些还有特殊的蛋白折叠机制，如共表达蛋白伴侣以改善蛋白折叠、提高表达效率。细菌表达系统还可以在商业化规模和人用治疗领域生产抗体片段及其衍生物。尽管有各种优势，但是
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系统最大的缺陷在于缺乏翻译后修饰机制，由此导致繁琐的表达和纯化工艺开发。
在啤酒酵母的克隆开发方面，几十年来构建了单拷贝和多拷贝载体，现在可作为重组蛋白表达质粒。与
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不同，载体转化酵母后，目的基因稳定整合到宿主基因组中，产生稳定的细胞系，用于商业化大规模生产。为了提高基因表达，合理设计或全合成的启动子被成功用于啤酒酵母。
Curran等通过降低核小体亲和力开发了一个增强的启动子，经修饰的酵母CYC1启动子的转录活性比野生型CYC1增强了16倍。
毕赤酵母克隆开发
毕赤酵母系统可以灵活选择合适的载体和相应的宿主，以获得重组蛋白的高表达且经济，这对一个成功的产品开发来说是最重要和首要的条件。与啤酒酵母相似，单基因和多基因同样可以整合到毕赤酵母基因组，以高表达目的蛋白。强效和严谨调控的乙醇诱导启动子（AOX）能高表达重组蛋白。AOX1和AOX2 基因编码乙醇氧化酶，主要负责细胞内的乙醇氧化。经甲醇诱导，AOX1的表达可至极高水平，超过细胞中总可溶性蛋白的30%。AOX1基因被整合到毕赤酵母表达载体，实现目的基因的高表达。AOX2与AOX1的同源性为97%，用于分离MutS菌株，带有该基因的菌株在甲醇存在下中生长速率比带AOX1基因的菌株慢很多。在葡萄糖、甘油或乙醇等碳源存在下，AOX1启动子受到严格抑制。去除上述碳源后，启动子去抑制，只有当加入甲醇诱导后才能完全被诱导并生产蛋白。
多种载体（pPIC9，pPICZα-A、B和C，等）和菌株（GS115、KM71、X33等）已经商品化，为选择和克隆目的基因并实现蛋白的高表达提供了方便（图2）。
