设计多色流式分析的10个诀窍

生物通 · 公众号 · · 2017-05-31 17:47

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制备方法不当或不健康的细胞可能导致结果不佳，因为细胞死亡或结块。在制备细胞时，你应当温柔地对待它们，避免剧烈的涡旋振荡。在染色时，如果实验允许，细胞应放在冰上。细胞团块会阻塞流式细胞仪，为了减少团块的形成，应避免高的细胞密度。加入DNase I或EDTA，也是个好办法。

去除死细胞

死细胞可能带来假阳性的结果，因为自发荧光以及非特异的抗体结合增加。通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）设门不一定能排除死细胞，因此最好是使用活细胞/死细胞的染料。人们通常用碘化丙啶（PI）或7-AAD来鉴定死细胞，但这不适用于固定细胞。现在Bio-Rad还提供一种VivaFix™活细胞/死细胞染料，适用于活细胞或固定细胞。

优化你的染色操作

抗体的非特异结合可能导致假阳性。通过添加BSA来封闭这些相互作用，可以减少这种非特异的结合。此外，许多细胞（如B细胞、NK细胞和巨噬细胞）在细胞表面有Fcg受体，可与抗体的Fc区域结合，造成非特异的染色。这些可通过添加FcR封闭试剂或使用F(ab)2片段来避免。高的抗体浓度也会增加非特异的结合。因此，抗体浓度应准确测定，以便提高信噪比。使用适当的抗体浓度是多色流式分析的关键。