赵旭东｜胰腺癌循环肿瘤细胞检测及临床应用进展

赵旭东　马永蔌　田孝东　杨尹默

｛北京大学第一医院普通外科｝

胰腺癌的恶性程度高，70%~80%的患者一经确诊即因局部进展或远处转移失去手术机会，预后极差，总体5年生存率仅8%[1]。手术切除是目前可能治愈胰腺癌的唯一方式，但即使是"可切除"的胰腺癌患者，术后亦多于1~2年出现肿瘤复发或转移，中位生存期仅20~25个月。对胰腺癌复发、转移机制的探讨是近年来的热点课题，其中液体活检如循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、cell-free DNA（cfDNA）检测的意义受到较多关注。

CTC为实体肿瘤原发病灶或转移灶释放入血的肿瘤细胞，具体机制可能通过上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）实现[2,3]，在血液中以单个细胞或细胞簇[4]形式存在。目前CTC可利用免疫磁珠、膜滤过、微流控芯片等技术进行分选。由于CTC数量稀少，同时混杂众多的血细胞，且因异质性较高，完整分选CTC并予准确定性面临诸多技术问题，临床应用仍存在争议。

免疫磁珠法包括正性富集和负性富集两种方式。正性富集是利用特定单克隆抗体[抗上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、抗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）等]靶向捕获目标CTC，所获得的CTC纯度较高，但部分CTC因EMT使EpCAM表达下调，导致漏检；此外，混杂细胞同样可表达EpCAM，存在一定假阳性可能。负性富集则是利用白细胞抗原（CD45）去除混杂白细胞，因CTC数量远少于混杂细胞，其获得的CTC纯度不如正性富集。Lapin等[5]尝试改进负性富集方法，设计利用CD45、CD16、CD19、CD163、CD235a/GYPA等多重标志物去除血细胞的MINDEC系统，并采用8种胰腺癌细胞株各1 000个癌细胞与外周血混合后进行验证，发现其平均回收效率可达到（82±10）%。与正性富集相比，其优势在于可同时获得上皮性及间质性CTC，且所富集的CTC未被磁珠标记，便于进一步体外培养及分析。如Xu等[6]运用负性富集分选CTC，并采用免疫荧光原位杂交技术以8号染色体非整倍体为标准鉴定CTC，该研究共纳入40例胰腺癌患者，CTC阳性率达90%（≥1 CTC），进一步分析结果显示，三倍体CTC≥3亚组患者预后明显更差（中位生存期13个月比6.03个月，P=0.018 8）。

CTC体积大于血细胞，且易聚集成团，膜滤过技术即通过两者直径差异分选CTC。Bobek等[7]设计基于该原理的MetaCell系统检测24例胰腺癌患者外周血CTC，16例患者（66.7%）每8 ml外周血中可检出至少1个CTC。此技术的优势在于操作过程简单、方便，分选过程和上述细胞表面标志物无关，有利于进一步行分子生物学检测。Poruk等[8]认为，CTC具有明显异质性，表达干性标志物的亚群与肿瘤转移、免疫逃逸及耐药有关，鉴定此类亚群比总体计数更具临床诊治意义。其利用直径差异分选CTC后，采用细胞角蛋白（cytokeratin，CK）、CD44、CD133及乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）等干细胞标志物鉴定所分选的CTC，发现60例病理学诊断明确的胰腺癌患者中有47例（78%）CTC表达CK和上述至少一种干性标志物，46例（77%）患者CTC同时表达CK和ALDH，34例（57%）同时表达CK、CD133、CD44（三阳CTC）。多因素分析结果显示，ALDH阳性表达及三阳CTC为肿瘤复发及预后的独立预后因素，即使肿瘤可切除，仍建议此类患者术前行新辅助化疗。但此技术亦存在一定缺陷：分选过程中滤过膜容易堵塞，且直径较小的CTC可能漏检。微流控芯片技术同样可依据直径差异分选CTC，可有效克服膜滤过技术样本处理速度低、特异性差的缺陷。Lin等[9]设计基于此原理的Labyrinth系统，并采用PANC-1细胞株进行验证，癌细胞回收率可达（92.4±3.2）%，同时（89.0±1.1）%的白细胞被筛除。此外，该技术的优势在于可在富集后继续保持细胞活性以供进一步分析研究。

综上所述，基于上述各技术已经建立较为成熟的CTC检测体系，但不同检测方法的样本处理速度、CTC回收效率、纯度、细胞活性等仍存在较大差异，目前可依据研究目的及实验条件适当选用。

胰腺癌病程隐匿，早期诊断困难。CA19-9作为常用标志物其灵敏度和特异度有限，易受其他因素影响，如Lewis抗原阴性患者血清CA19-9水平并不升高。CTC在病程早期即可释放入血[3]，检测外周血CTC理论上有助于提高疾病早期诊断率。Gao等[10]采用负性富集及免疫荧光原位杂交技术鉴定CTC，以CTC≥2作为阳性标准，联合使用CA19-9检测25例胰腺癌患者，阳性检出率达100%，表明CTC联合CA19-9适用于高危患者的监测，CTC阳性有助于CA19-9阴性患者的鉴别诊断。Ankeny等[11]利用微流控芯片技术检测72例胰腺癌患者初治前外周血CTC，阳性（≥1 CTC/4 ml）54例，阳性率为75%（灵敏度75.0%，特异度95.7%），且证实CTC较CA19-9能更好地鉴别早期及进展期病变。

利用CTC行单细胞测序逐渐显示出重要应用前景[12]，可有效克服肿瘤异质性，比较分析CTC之间，以及CTC同肿瘤原发灶和转移灶之间单细胞基因组、转录组和表观遗传组的差异或可揭示肿瘤发生机制，从而实现早期诊断、筛选敏感性药物并预测预后。Rhim等[13]认为胰腺癌肿瘤病灶形成前导管上皮细胞即可释放入血，称为循环上皮细胞（circulating epithelial cell，CEC），其对11例胰腺癌、21例胰腺囊性病变、19例正常对照行CTC或CEC检测后发现，各组阳性率分别为73%、33%、0（设定>3个/ml为阳性）。进一步可尝试通过基因测序分析比较胰腺癌CTC及囊性肿瘤CEC的相应特征，确认囊性肿瘤CEC基因组是否包含癌变早期信息，以此行癌变危险程度分层，确定患者是继续随访观察还是手术切除。

Ankeny等[11]从5例胰腺癌患者中分离出44个CTC后行基因检测，发现KRAS基因12密码子点突变检出率为47.7%（21/44），其中1例患者表现为G12V突变，另4例患者为G12D突变，通过与相应肿瘤组织的石蜡切片进行对比发现，均符合原发肿瘤基因的突变情况。由于90%以上的胰腺癌患者肿瘤细胞中存在KRAS基因突变，通过检测CTC中该基因的突变有助于早期诊断。尤其对于病灶隐匿、多次穿刺均为阴性的可疑胰腺癌患者，利用CTC行单细胞测序更具诊断及鉴别诊断意义，重复采血或可监测肿瘤发展进程。

上述研究结果表明，CTC作为标志物有一定早期诊断意义。由于方法学限制，CTC的特异性虽高，但灵敏度有限，目前还难以成为胰腺癌早期筛查的常规措施。未来将从单细胞测序等分子层面挖掘生物学信息，有望在早期诊断与鉴别诊断、癌变预测、疾病进展监控等方面发挥更多作用。

化疗对胰腺癌有重要治疗作用，可于化疗前后实时、连续检测CTC，通过观察细胞计数、染色体核型或基因组变化，评估化疗效果及药物敏感性。既往研究结果表明，进展期胃癌非正常核型CTC同化疗耐药相关，可预测化疗的药物敏感性[14]。Xu等[6]对40例胰腺癌患者资料进行研究后发现，1周期化疗后三倍体CTC较化疗前明显减少，推测如果化疗后三倍体CTC较化疗前升高，提示化疗耐药。Yu等[15]利用32例接受过吉西他滨治疗的胰腺癌患者肿瘤样本建立了人源胰腺癌裸鼠移植瘤模型，将其中化疗敏感和化疗耐药患者的基因表达序列进行对比，明确化疗敏感患者中涉及吉西他滨代谢的过表达基因序列，以此建立药物敏感性分析模型。同时从50例不可切除胰腺癌患者的外周血中富集CTC，并提取足够数量的RNA检测肿瘤基因表达情况，并将CTC基因序列同上述药敏模型比较后分为三组：化疗敏感组、化疗耐药组和中间组。该研究对入组的胰腺癌患者进行持续随访后发现，化疗敏感组较化疗耐药组患者的疾病无进展生存期（10.4个月比3.6个月，P<0.01，HR=0.14）及总体生存期（17.2个月比8.3个月，P<0.05，HR=0.29）均延长，提示CTC对预测化疗灵敏度有重要意义。

厄洛替尼联合吉西他滨对转移性胰腺癌具有一定作用[16]。随着药物的使用，肿瘤细胞EGFR基因相应位点发生二次突变、靶点缺失及下游信号转导通路非依赖于EGFR的持续性活化，可致耐药。通过化疗前后对CTC EGFR基因的检测，可了解突变情况，及时调整化疗方案，实现个体化治疗。此类检测在非小细胞肺癌患者中应用较多，Yanagita等[17]报告了一项厄洛替尼的二期临床试验，该试验对因疾病进展停止靶向治疗的38例非小细胞肺癌患者进行CTC检测，47%（18/38）检测出CTC，其中3例检测出MET扩增提示耐药，包括2例有创活检未能明确的病例。研究结果证实，cfDNA和CTC作为无创、实时检测方式，有助于监测治疗过程中耐药情况，尤其适用于病理标本取材困难者。

对CTC的研究虽有助于提供治疗靶点并评估化疗的药物敏感性，但由于可供选择的化疗药物有限，临床应用不多，多为小样本量的探索性研究。但作为个体化治疗的方向，其应用前景广阔。

既往研究结果证实，MUC-1在胰腺癌中的高表达可增加肿瘤细胞的迁移、侵袭，其机制可能与诱导EMT转化有关[18]。Dotan等[19]对48例转移性胰腺癌患者初治前外周血标本进行检测，其中23例（48%）CTC阳性（≥1 CTC/7.5 ml），而阳性患者中10例（43%）可检测出MUC-1表达；生存分析结果显示，MUC-1阳性表达与阴性表达患者的生存时间存在显著差异（2.7个月比9.6个月，P=0.044）。一项基于9项研究共计623例患者的Meta分析包括268例CTC阳性及355例阴性患者资料，两组生存时间的差异有统计学意义（P<0.01）[20]。另一项共计纳入16项研究的Meta分析结果亦显示，首诊时播散肿瘤细胞或CTC阳性患者预后较差（P<0.01）[21]，且外周血CTC较骨髓播散肿瘤细胞对患者预后更具预测意义。但受限于CTC检测方法学，两项Meta分析所入组的研究在CTC阳性判断标准方面并不统一，亟需方法学的完善与规范，并通过进一步临床试验确认最佳检测方法及相应诊断界点。

综上所述，通过对胰腺癌患者外周血CTC数量的检测及表型、基因型等生物学信息的分析，对胰腺癌早期诊断、治疗及预后评估有一定帮助，但因检测方法尚无统一标准、缺乏大规模多中心临床研究验证，相关证据等级不高。方法学层面仍有待建立更为有效的富集手段，准确反映出CTC的客观状态，此为指导临床实践的必要基础；通过CTC基因序列分析、体外培养并建立体内移植瘤模型，并与原发病灶进行比较研究，可望获取更多肿瘤生物学信息，有助于靶向及个体化治疗，体现出CTC临床应用的广阔前景。

（参考文献略）

题图  via G. Gercken