进展 | 利用深度突变扫描技术对BRCA1变异进行准确ACMG分类

正文

请到「今天看啥」查看全文

在这项研究中，我们旨在应用基因组编辑技术，测量BRCA1关键区域所有可能单核苷酸变异（SNVs）的功能后果，无论这些变异是否曾在人类中被观察到。考虑到BRCA1基因的庞大，我们优先选择了13个外显子，这些外显子编码了RING和BRCT结构域，这些结构域在BRCA1作为肿瘤抑制因子的功能中起着至关重要的作用。除了约400个意义未明变异（VUS）或解释存在冲突的变异外，所有21个被ClinVar认证的专家小组分类为致病性的BRCA1错义SNV都位于这些外显子中，功能实验中显示能够破坏BRCA1功能的错义和剪接变异也位于这些外显子内（ClinVar是一个广泛使用的临床变异解释数据库，由临床检测实验室提交）。在每个实验中，我们对单个外显子进行饱和基因组编辑（SGE），在该过程中同时引入所有可能的SNV，并同时进行检测。我们使用SGE测量了3,893个SNV的功能效应，涵盖了目标外显子中96.5%的所有可能SNV。这些评分呈双峰分布，并几乎与基于专家评估的致病性判断完全一致。我们预测，基于功能分类的结果将具有及时的临床应用价值，并且将这一方法扩展到其他基因，将大大增强遗传检测的实用性。

结果

许多与同源重组修复（HDR）通路相关的基因，包括与遗传性癌症易感性相关的基因，如BRCA1、BRCA2、PALB2和BARD1，在基因捕获筛选中被最近鉴定为在人类单倍体细胞系HAP1中是必需的（图1a）。为了验证这一发现，我们设计了引导RNA（gRNA）靶向这些基因的外显子，并在共表达Cas9和嘌呤霉素抗性盒的质粒转染后，评估了HAP1细胞的活性（图1b）。通过光学显微镜观察到显著的细胞死亡，基于荧光的存活检测实验表明，靶向这些基因中的任何一个都会显著降低HAP1细胞的存活率，且在一周内效果明显（扩展数据图1）。对BRCA1靶向细胞编辑位点的深度测序确认，细胞死亡是由于突变引起的，因为我们观察到在选择反向框移的插入缺失（indel）时，存在对未编辑位点和某些框内插入缺失的广泛选择。总体而言，这些结果确认了HDR通路组分在人类HAP1细胞中的必需性，并确立了靶向测序作为区分功能性与非功能性BRCA1变异的策略，适用于编辑后的HAP1细胞群体。

请到「今天看啥」查看全文