正文
功能验证：
为了验证TRPM4的作用，使用三种sgRNA生成了TRPM4敲除（KO）的MCF7细胞。TRPM4的删除完全阻断了NC1诱导的细胞死亡（图1b,c和补充图2a）。
重新引入人类TRPM4（hTRPM4）恢复了NC1敏感性，而TRPM4抑制剂9-phenanthrol剂量依赖性地减轻了NC1诱导的细胞死亡（图1d和补充图2b,c）。此外，离子不可渗透的TRPM4突变体D984A未能挽救TRPM4-KO细胞中的坏死表型，证实了TRPM4的离子通道活性对NC1诱导的坏死是必需的（图1d）。
这些结果确立了TRPM4在NC1诱导的细胞死亡中的关键作用。
NC1直接结合并激活TRPM4:
通过细胞热转移实验（CETSA）和表面等离子体共振（SPR）分析，证实NC1直接结合TRPM4，亲和力为0.88 μM。NC1的结合稳定了TRPM4，而其无活性异构体（NC1i）则无此效果(图1e、1f)。这些结果表明，NC1特异性结合TRPM4并诱导细胞死亡。
NC1激活TRPM4的离子通道活性：
研究人员使用全细胞膜片钳的结果显示，NC1强烈诱导了TRPM4依赖的电流（半最大有效浓度（EC50）≈306.3 nM），加入TRPM4抑制剂9-phenanthrol后，电流被9-phenanthrol抑制，证实了TRPM4的特异性。在野生型（WT）MCF7细胞中，NC1引发了强电流，而TRPM4敲除则阻断了这一效应（图1g,h）
值得注意的是，在无细胞系统中，NC1在外侧膜片上激活TRPM4，且触发的电流持续增加，即使冲洗后也未减弱，表明NC1对TRPM4的激活是持续且不可逆的。
图
1：
TRPM4在NC1诱导的细胞死亡中的作用
2.NC1通过TRPM4诱导的坏死由钠离子内流驱动
TRPM4是一种钙激活的非选择性单价阳离子通道蛋白。NC1处理后，钠离子水平增加，钾离子水平下降，而钙、镁和铁离子水平稳定，表明钠离子内流和钾离子外流显著（图2a）。离子敏感探针进一步证实了这些变化：NC1处理的MCF7细胞中，钠离子荧光增加，钾离子荧光减少（图2b,c）。
为确定钠离子内流还是钾离子外流驱动NC1诱导的坏死，将培养基中的NaCl替换为不可渗透的NMDG-Cl。钠离子缺失阻断了NC1诱导的细胞死亡，表明钠离子内流是关键因素；而提高钾离子浓度抑制钾离子外流未影响细胞死亡，表明钾离子外流是伴随事件（图2d,e）。ICP-MS证实钠离子内流和钾离子外流被阻断（图2f），且NMDG-Cl去除钠离子阻断了钠离子内流和细胞死亡，但不影响钾离子外流（图2e,f）。
进一步实验显示，降低EBS中钠离子浓度逐渐减弱NC1的杀伤活性（图2g），用其他单价阳离子替代钠离子不同程度抑制细胞死亡（图2h），突出了钠离子内流的主要作用。TRPM4敲除完全阻断了钠离子内流，证实了TRPM4的关键作用（图2i）。
NC1通过诱导钠离子内流触发TRPM4依赖的坏死性细胞死亡，这种坏死被定义为钠超载诱导的坏死（NECSO）。通过替换钠离子、使用抑制剂和渗透压调节剂，进一步验证了钠离子内流在NECSO中的核心作用。
图
2：
NC1通过TRPM4诱导的坏死由钠离子内流驱动
3.NC1通过作用于跨膜（TM）区域特异性靶向人源TRPM4通道。
研究了TRPM4表达水平与细胞对NECSO敏感性的相关性，在9种人类癌细胞系中，表达TRPM4的程度对NC1敏感度呈现高度相关性，值得注意的是，尽管部分小鼠细胞的TRPM4表达水平与某些人类细胞系相当，但小鼠和仓鼠的正常及癌细胞对NC1的耐药性比人类细胞高出1,000倍以上（图3a），提示物种特异性差异可能赋予NC1抗性。
为验证NC1是否特异性靶向hTRPM4，我们在TRPM4敲除的MCF7细胞中重新表达人源或小鼠TRPM4 (mTRPM4)。只有hTRPM4能恢复对NC1的敏感性（图3c）。CETSA实验证实NC1结合hTRPM4而不结合mTRPM4（图3d）。此外，NC1激活了hTRPM4通道活性，但对mTRPM4无效（图3e），证明NC1对人源TRPM4的特异性。
实验显示，小鼠等物种的TRPM4同源物对NC1诱导的NECSO无响应,此外，其他TRPM家族成员（包括近缘的TRPM亚型）也不响应NC1（图3h及补充图3a-d）。这些结果表明NC1是hTRPM4的高特异性激动剂，仅在表达hTRPM4的细胞中诱导NECSO。
TRPM4跨膜区决定NC1敏感性
不同物种来源的TRP蛋白对刺激表现出不同的敏感性，这有助于识别参与配体结合或激活的受体结构域。hTRPM4和mTRPM4具有88.4%的序列相似性和相似的四聚体结构，且拥有保守的磷酸化、SUMO化修饰和糖基化等调控修饰。然而它们的NC1敏感性差异显著（图3c）
研究人员通过结构域交换分析确定了NC1敏感性所需的结构域。将hTRPM4和mTRPM4分为三个片段：N端（人类1-767，小鼠1-763）、跨膜区（TM）（人类768-1093，小鼠764-1089）和C端（人类1094-1214，小鼠1090-1213）（图3i）。TRPM4的TM片段包含pre-S1（S0）结构域、S1-S6核心跨膜结构域以及嵌入脂质层的TRP结构域。
