正文
sonic hedgehog
，
SHh
）、
GLI
家族锌指蛋白
1
（
GLI family zinc finger protein 1
，
Gli1
）、
G
蛋白偶联受体蛋白（
smoothened
，
Smo
）、原癌基因蛋白（
cellular-myelocytomatosis viral oncogene
，
c-Myc
）、苏氨酸蛋白激酶
Fused
抑制因子（
suppressorof Fused
，
SuFu
），武汉三鹰生物技术有限公司；表面受体（
Patched
，
Ptch1
），美国
Immunoway
公司。细胞凋亡相关抗体：
B
细胞淋巴瘤
/
白血病
-2
蛋白（
B-cell lymphoma-2
，
Bcl-2
），美国
Immunoway
公司；
Bcl-2
相关
X
蛋白（
Bcl-2 associated X protein
，
Bax
），武汉三鹰生物技术有限公司。内参抗体：甘油醛
-3-
磷酸脱氢酶（
glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase
，
GAPDH
）、山羊抗兔
IgG
二抗，杭州联科生物技术股份有限公司。
1.3
仪器
3001
多功能酶标仪（美国
Thermo
公司）；
SW-CJ-2FD
超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；
DMI3000B
倒置显微镜、
SP8 SR
激光共聚焦显微镜（德国
Leica
公司）；
QUOTQTION
电泳仪、化学发光凝胶成像系统（美国
Bio-Rad
公司）
Forma3111CO
2
培养箱（美国
Thermo
公司）；
AllegraX
®
-12series
离心机（美国
BECK MAN Coulter
）；
CYT5MFV
微孔板成像系统（美国
BioTek
公司）。
2
方法
2.1
细胞培养
SW480
细胞用含有
10%
胎牛血清和
1%
青霉素和链霉素的
DMEM
培养基培养，放置于
37
℃
、
5% CO
2
的环境中。根据细胞生长情况，
2
～
3 d
更换新鲜培养基，待细胞生长面积达
80%
～
90%
时，按
1
∶
2
比例进行传代，传至第
5
代后部分用于保存，部分用于后续实验。
2.2
光学显微镜下观察细胞生长
、
细胞形态
取出处于对数生长期的
SW480
细胞，经胰蛋白酶消化并收集细胞后，以
1.0
×
10
5
个
/mL
的细胞密度，
500 μL/
孔的体积接种于
24
孔细胞培养板中，培养
12 h
待细胞贴壁后，对照组更换含
0.1%
二甲基亚砜（
dimethyl sulfoxide
，
DMSO
）、给药组更换含不同浓度（
5
、
10
、
20 μmol/L
）熊果酸、阳性药
组更换
GANT-61
（
20μmol/L
）的培养基（
100 μL/
孔）
处理细胞，继续培养
24 h
后，于微孔板成像系统中观察记录细胞生长情况和细胞形态。
2.3
MTT
比色法检测细胞增殖
采用“
2.2
”项方法处理细胞，以
1.0
×
10
4
个
/mL
的细胞密度，
100 μL/
孔的体积接种于
96
孔细胞培养板中，培养
12 h
待细胞贴壁后，对照组更换含
0.1% DMSO
、给药组更换含不同浓度（
5
、
10
、
20
、
40
、
60
、
80
、
100
、
120
、
140 μmol/L
）熊果酸的培养基（
100
μL/
孔）处理细胞，继续培养
24 h
后，更换含
5 mg/mL
MTT
的培养基（
100μL/
孔）处理细胞，继续培养
24 h
后，更换含
5mg/mL MTT
的培养基（
100 μL/
孔）
处理细胞，继续培养
4 h
后，更换
DMSO
（
150 μL/
孔）
处理细胞结晶，振荡
10
～
15min
，待结晶物充分溶解后，在酶标仪中测定波长
570 nm
下的吸光度（
A
）值，并计算细胞存活率。
细胞存活率＝
A
药物
/
A
对照
2.4
划痕实验检测细胞迁移能力
