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事实上,David Baker 团队已经使用RFdiffusion生成基于相似理想支架的结合蛋白,同时也测试了无约束扩散,但仅产生了简单的三螺旋或四螺旋束。使用具有规则二级结构元素和堆积的小型理想支架的优势在于,经过序列设计后,相当一部分设计有可能按预期折叠。然而,这种方法限制了形状匹配的程度,特别是对于那些表面相对平坦且缺乏凹陷以供小型迷你蛋白适应的靶标。实际上,目前为止,自主设计的结合蛋白的接触分子表面(CMS)低于许多天然蛋白复合物。
在这项最新研究中,David Baker 团队推测,通过使用RFdiffusion直接从完全随机的氨基酸残基分布生成较大蛋白质,可以克服依赖支架或短链方法所能实现的有限形状匹配,而无需依赖于现有支架的指导。
研究团队聚焦于肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF),该家族包含许多重要的药物靶点,例如在炎症性疾病中发挥关键作用的肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)。通过应用RFdiffusion,研究团队生成了96个可能与TNFR1结合的人工设计蛋白,而表面等离子体共振(SPR)实验表明,有6个人工设计蛋白可与TNFR1结合,其中TNFR1_mb1和TNFR1_mb2具有与TNFR1结合的高亲和力,并同时具有高度特异性——只与TNFR1结合,而不与TNFR2结合。
为了进一步优化TNFR1_mb2和TNFR1_mb1的亲和力,David Baker 团队采用了部分扩散的方法:对骨架部分进行噪声化处理(超过15-25步;50步产生完全随机分布),然后使用RFdiffusion去噪,这产生了与原始设计相似但不同的新骨架。
令人惊讶的是,部分扩散优化处理产生的TNFR1_mb2_pd1与TNFR1的结合亲和力增加了三个数量级,达到低于10 pM。这种低皮摩尔级的亲和力远高于任何此前报道的单体TNFR1结合蛋白。例如,肿瘤坏死因子(TNF-α)作为天然存在的TNFR1结合蛋白,其与TNFR1的结合亲和力也仅为19 pM。
研究团队表示,在优化后的TNFR1_mb2_pd1中,部分扩散所带来的亲和力的显著增加可能是由于额外的界面以及与结合裂缝之间更好的整体拟合,这导致了多个附加接触点的形成。
鉴于部分扩散在增加结合亲和力方面的成功,研究团队进一步测试了该方法是否可以应用于其他TNFR家族成员,这些成员在序列上是不同的,但具有非常相似的三维结构。结果显示,这种设计方法可以很好地应用到其他TNFR家族成员的人工结合蛋白的设计、筛选和优化中。