黄绵马酸BB对革兰阳性致病菌的抗菌活性和生物被膜清除作用研究

中草药杂志社 · 公众号 · 药品 · 2021-05-08 13:18

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[ ^9] ，但黄绵马酸 BB 对革兰阳性球菌生物被膜形成的作用暂无报道。本研究通过探究黄绵马酸 BB 对革兰阳性常见致病菌 MRSA 、 EFA 和 EFM 的抗菌活性和生物被膜的清除作用，为黄绵马酸 BB 的抗感染新药开发提供参考。

1 材料

1.1 菌株

10 株 MRSA 临床分离株（ MRSA1 ～ 10 ）、 4 株粪肠球菌临床分离株（ EFA1 ～ 14 ）、 1 株屎肠球菌临床分离株（ EFM15 ）由广东莱恩医药研究院有限公司惠赠。

1.2 药品与试剂

黄绵马酸 BB （质量分数＞ 95% ）由课题组自制；万古霉素（质量分数＞ 97% ，批号 N0827A ）购自美国 Sigma 公司；达托霉素（质量分数＞ 97% ，批号 M0726A ）购自大连美仑生物技术有限公司；莫匹罗星（质量分数＞ 97% ，批号 80200123218 ）购自中美天津史克制药有限公司； CAMHB 营养肉汤培养基（批号 2017090 ）、营养琼脂培养基（批号 3105705 ）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（ TSB ，批号 1090952 ）购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 仪器

SW-CJ-1F 超净工作台（苏净集团安泰公司）； iMark 酶标仪（美国 BIO-RAD 公司）； Memmert 恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）； XYQ-SG46-280S 电热手提式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）； JEM-2100HR 冷场发射扫描电子显微镜（ SEM ，日本电子株式会社）。

2 方法

2.1 菌液制备

将上述菌株用营养琼脂培养基培养至对数生长期，根据美国临床实验室标准协会（ clinical and laboratory standardsinstitute ， CLSI ）制定的 M07-A9 方案中微量稀释法，将处于对数生长期的菌落用 CAMHB 营养肉汤培养基稀释成 1 × 10 ⁶ CFU/mL 的接种菌液 ^[10] 。

2.2 药液制备

黄绵马酸 BB 、莫匹罗星、万古霉素、达托霉素分别溶于二甲基亚砜，配制成质量浓度为 64 mg/mL 的药物储备液。

2.3 黄绵马酸 BB 对受试菌株的抗菌活性测定

采用微量稀释法测定黄绵马酸 BB 和阳性对照药物（莫匹罗星、万古霉素、达托霉素）对受试菌株的最小抑菌浓度（ minimum inhibitory concentration ， MIC ）和最小杀菌浓度（ minimumbactericidal concentration ， MBC ）。用 CAMHB 营养肉汤培养基将药物储备液进行稀释，取 100 μL 药物储备液加入 96 孔板中，再加入 100 μL 菌液，使黄绵马酸 BB 、莫匹罗星、万古霉素、达托霉素的终质量浓度均为 5.00 ～ 2 560.00 μg/mL ，对照组只加入菌液不加入药液。于 37 ℃恒温培养箱中培养 18 ～ 24 h 后，测定 MIC 。选择质量浓度≥ MIC 的菌悬液，吸取 20 µL 涂于固体培养基上，于 37 ℃恒温培养箱中培养 18 ～ 24 h 后肉眼观察，以无细菌生长的最低药物浓度作为 MBC 。

2.4 黄绵马酸 BB 对 MRSA2 、 EFA13 和 EFM15 生长曲线的测定

根据抗菌活性结果，选用对黄绵马酸 BB 敏感的 MRSA2 、 EFA13 和 EFM15 作为受试菌，测定黄绵马酸 BB 对其生长的影响。设置对照组及黄绵马酸 BB （ 1/2 MIC 、 MIC 、 2 MIC ）组，各给药组加入含相应药物的菌液，对照组只加入菌液不加入药液，于 37 ℃振荡培养，每 2 小时采用酶标仪测定 24 h 内 600 nm 处的吸光度（ A ）值。以时间为横坐标， A 值为纵坐标，绘制时间 - A 曲线。

2.5 黄绵马酸 BB 对 MRSA2 、 EFA13 和 EFM15 生物被膜的清除作用

2.5.1 MRSA2 、 EFA13 和 EFM15 生物被膜生长曲线的测定用 TSB 培养基将菌悬液稀释至 1 × 10 ⁶ CFU/mL ，取 200 μL 接种于 96 孔板中，于 37 ℃分别培养 0 、 3 、 6 、 9 、 12 、 24 、 36 、 48 h ，弃去悬浮菌液，