Nature | 突破性发现：CREM揭示CAR-NK细胞“疲惫”之谜，抗癌效力有望飙升！

生物探索 · 公众号 · 生物 · 2025-06-06 16:35

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为了进一步探究CREM在肿瘤免疫中的普遍性，研究人员分析了来自TISCH2数据库的肿瘤浸润NK细胞（tumor-infiltrating NK, TI-NK）数据。惊人地发现，在多种癌症类型中，TI-NK细胞的CREM表达量普遍高于外周血单核细胞（PBMC）中的NK细胞。特别是在膀胱癌、胆管癌和肺癌中，TI-NK细胞的CREM表达量显著增高。更有趣的是，在胰腺癌患者的转移性TI-NK细胞中，CREM的表达量达到了最高水平，甚至在差异活跃的转录因子调控网络中排名前50位。这些数据强烈暗示，CREM在肿瘤微环境中的高表达可能与NK细胞的功能受损有关，甚至在某些情况下，高CREM表达与患者不良预后（如低级别胶质瘤、肺腺癌、胃腺癌和乳腺浸润性癌）相关。这进一步强化了CREM作为免疫检查点的潜在角色。

研究人员还利用质谱流式细胞术（mass cytometry, CyTOF）对NK细胞的表型进行了深入剖析。研究显示，高表达CREM的CAR-NK细胞（特别是CAR70-IL-15 NK细胞）同时伴随着激活标志物（如NKG2D、CD25、CD2、GZMB和Perforin）和抑制性标志物（如NKG2A、LAG3、TIGIT和TIM3）的更高表达。这一发现进一步佐证了CREM的诱导可能与NK细胞的“激活诱导性疲惫（activation-induced exhaustion）”表型密切相关，它在介导抗肿瘤活性的同时，也可能启动了负反馈调节机制。

“点火器”的秘密：CAR激活与IL-15如何诱导CREM

既然CREM如此重要，那么它究竟是如何被CAR-NK细胞激活的呢？研究人员深入研究了CAR活化信号和IL-15细胞因子信号对CREM表达的影响。

当CAR-NK细胞与靶抗原（CD70）结合时，CREM的表达量在CAR70 NK细胞中显著升高，与未转导的NK细胞或缺乏胞内信号域的CAR-NK细胞相比，CREM mRNA表达量可增加约6倍。这明确指出，CAR分子内部的ITAM（Immunoreoreceptor Tyrosine-based Activation Motif）信号在CREM诱导中扮演了关键角色。

IL-15作为CAR-NK细胞疗法中常用的促增殖和持久性细胞因子，也展示了其对CREM的强大诱导能力。IL-15能够以剂量依赖的方式（从50 pg/mL到5000 pg/mL）显著增加CREM的表达，其诱导强度甚至高于等剂量的IL-2。当CAR激活与IL-15刺激同时存在时，CREM的表达量呈现出叠加效应，这意味着这两种信号通路可以协同作用来诱导CREM。CREM mRNA的表达在IL-15刺激后6小时即可上调，并在24-48小时达到峰值，在96小时内回到基线，显示出其转瞬即逝的诱导特性。而在持续分泌IL-15的CAR-IL-15系统中，CREM则持续高表达。

除了CAR和IL-15，研究人员还测试了其他常见细胞因子和内源性NK细胞受体对CREM表达的影响。结果显示，IL-2、IL-12和IL-18也能剂量依赖性地诱导CREM表达，其中IL-15的诱导作用最强。此外，通过抗CD16、抗NKp30和抗NKp46抗体激活NK细胞内源性受体，也同样能上调CREM表达。这表明，CREM的上调是NK细胞活化的一个普遍特征，由细胞因子和ITAM信号共同驱动，并且其强度和动力学特征因刺激类型而异。

机制揭秘：PKA-CREB轴的“幕后推手”

既然CREM在NK细胞活化中如此重要，那么其信号通路是怎样的呢？研究深入剖析了CREM诱导的分子机制，揭示了PKA-CREB信号轴的关键作用。

CAMP信号通路在细胞中扮演着重要角色，而CREM正是其关键调控因子之一。当细胞内CAMP水平升高时，蛋白激酶A（PKA）会被激活，进而磷酸化转录因子CREB和CREM。这些磷酸化的转录因子结合到CAMP反应元件（CAMP-response elements, CREs）上，调控靶基因的转录。研究证实，这一经典的PKA-CREB轴在CAR-NK细胞活化中发挥了核心作用。

具体而言，CAR激活能够导致CAR70 NK细胞中CREB的显著磷酸化（pCREB），但这种磷酸化在未转导或缺乏胞内信号域的CAR-NK细胞中不明显。这意味着CAR分子的CD3ζ链信号在诱导pCREB中至关重要。更有力的是，当预处理NK细胞，使用PKA抑制剂H89或钙螯合剂EGTA时，CAR诱导的CREB磷酸化和CREM诱导都被强烈抑制了。这与之前T细胞受体（TCR）信号下游PKA磷酸化CREB的发现不谋而合。

IL-15同样能以剂量依赖的方式增加PKA活性和pCREB水平，且H89和EGTA也能有效阻断IL-15诱导的CREB磷酸化和CREM表达。这有力支持了PKA-CREB轴在CAR激活和IL-15刺激介导的CREM上调中扮演的关键角色。

研究人员还通过染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）和定量PCR（qPCR）实验，进一步证实了pCREB能够强烈结合CREM启动子（CREM promoter 1），其结合强度与CREM的转录水平呈正相关。这表明CREM很可能是一个直接被CREB调控的靶基因。

值得注意的是，IL-15还通过JAK-STAT通路激活NK细胞，特别是STAT3和STAT5。数据显示，IL-15能够剂量依赖性地增加pSTAT3和pSTAT5，其中pSTAT5表现出更高的敏感性。虽然STAT3和STAT5也参与了CREM的诱导（STAT3或STAT5的缺失部分降低了CREM表达），但CREM的诱导在CAR激活后仍能独立于STAT信号发生，主要依赖于PKA-CREB轴。这揭示了CAR-NK细胞中CREM调控的双重机制：通过PKA-CREB信号轴和IL-15下游的STAT3-STAT5通路。

解除“封印”：CREM删除后的CAR-NK细胞威力大增！

既然CREM在NK细胞活化中扮演了复杂的角色，那么，删除CREM是否能提升CAR-NK细胞的抗肿瘤能力呢？研究人员运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在CAR-NK细胞中特异性敲除了CREM。

在体外实验中，CREM缺失（CREM KO）的CAR-NK细胞展示出显著增强的细胞毒性。无论是长期的二维培养、三维肿瘤球体（tumor spheroid）培养，还是肿瘤再挑战实验中，CREM KO的CAR-NK细胞都表现出更强的杀伤能力。例如，在针对UMRC3细胞的球体杀伤实验中，CREM缺失的CAR70-IL-15 NK细胞在第5天时能够将肿瘤球体的平均绿色图像强度降低至对照组的约20%，而野生型细胞仅能降低至约40%，显示出更有效的肿瘤抑制能力。这种增强效应在低效应-靶细胞比率（effector-to-target ratio）下尤为明显，且无论肿瘤细胞是否表达靶抗原CD70，CREM的缺失都能提升IL-15分泌型NK细胞的效应功能，表明CREM作为IL-15或CAR信号下游的一个通用抑制性检查点。