主要观点总结
本文介绍了先进振动显微镜在生命科学中的革命性应用。通过相干拉曼散射和振动光热/光声效应，先进振动显微镜能够直接“看清”生命体中特定化学键的存在与分布，无需外部标记。文章详细阐述了其工作原理、应用场景及优势，展示了它在生物化学成像、药物研发、临床诊断等领域的广泛应用前景。
关键观点总结
关键观点1: 先进振动显微镜基于相干拉曼散射和振动光热/光声效应，实现了无标记的生物化学成像。
通过高速、高灵敏度的检测，先进振动显微镜能够直接观察活细胞和组织中特定化学键的存在与分布。其独特的化学键特异性，让我们能够揭示生命体更深层次的化学和功能信息。
关键观点2: 先进振动显微镜在生命科学中的应用已遍及多个尺度，从生物纳米颗粒到复杂的活体动物乃至人体皮肤。
例如，在病毒学研究中，它能够实现单个病毒的指纹识别；在微生物研究中，它可以快速测定细菌对抗菌药物的敏感性；在哺乳动物细胞研究中，它可以揭示细胞脂质代谢的关键机制。
关键观点3: 先进振动显微镜面临的主要挑战是提高检测灵敏度和特异性。
研究人员正在积极开发各种振动探针，以提高先进振动显微镜的灵敏度和特异性。未来的发展方向包括进一步提高成像速度、开发更多创新应用，并降低设备成本。
正文
然而，正如前面提到的，自发拉曼信号太弱，中红外吸收分辨率太低且受水干扰大，这些传统方法的局限性极大地限制了它们在生命科学中的应用，尤其是在需要高速、高灵敏度观察动态过程的场景。
为了解决信号微弱的问题，研究人员发展出了相干拉曼散射（CRS）显微技术，主要包括
相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering, CARS）和受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering, SRS）
。
CRS的基本原理是利用两束激光——泵浦光（pump）和斯托克斯光（Stokes），它们的频率差正好等于分子振动频率时，可以相干地驱动分子的振动，从而产生一个非常强的相干信号。CARS产生一个反斯托克斯信号，而SRS则是斯托克斯光的增强或泵浦光的减弱。
这项技术在速度和灵敏度上实现了巨大飞跃。通过将信号调制到MHz的高频，SRS显微镜（2008年首次报道）成功将信号从低频噪声中分离出来，实现了高灵敏度和高速生物医学成像。理论上，SRS与CARS具有同等水平的信噪比（SNR）。
扫描速度：
2005年，扫描式CARS实现了视频速率成像。2022年，宽场表面增强CARS更是达到了每秒120帧的成像速度。2016年， spatially multiplexed SRS 将帧率推高到2 kHz，实现了化学动力学的实时成像。
光谱获取速度：
通过光谱聚焦（spectral focusing）或光谱多重（spectral multiplexing）技术，可以快速获取分子的完整振动谱。例如，2016年和2017年的研究利用快速可调谐激光实现了千赫兹甚至更高的光谱获取速度。
3D成像：
结合Bessel光束或OCT技术，SRS实现了散射环境中两倍的成像深度（2017），并可以进行3D体积成像。
CRS技术不仅速度快，而且通过使用近红外（NIR）激光，可以最大程度地减少光损伤（photodamage）和非共振背景（nonresonant background）的影响。虽然非共振背景是CARS的一个问题，但研究人员也通过多种方法（如外差探测、相位匹配等）进行了有效抑制。
CRS是利用光与分子的相干振动相互作用，而振动光热/光声（VIP）显微镜则另辟蹊径，利用分子的振动吸收并转化为热的效应来成像。
VIP显微镜（比如中红外光热，MIP）采用“泵浦-探测”（pump-probe）方案。一束脉冲中红外光（泵浦光）被目标分子吸收，激发的振动能量在皮秒（picosecond）时间内迅速转化为热，导致局部温度升高。这种温度升高会引起样品微小的热膨胀，改变局部折射率（形成热透镜效应）。另一束可见光（探测光）穿过或散射通过这个区域时，其传播会受到影响，通过检测探测光的强度、相位或散射变化，就能间接感知到中红外光的吸收，从而获得化学对比度。
VIP的检测方式多样，可以基于散射、衍射、相位甚至荧光信号。特别是荧光检测的光热显微镜（F-MIP），利用一些对温度敏感的荧光探针，其荧光信号随温度的变化远高于散射信号的变化，灵敏度比基于散射的MIP提高了100倍（2021年报道），并且已实现了商业化。
除了光热效应，热量还会引起样品膨胀产生超声波，这就是振动光声（Vibrational Photoacoustic, VIPA）效应。通过探测这些超声波，可以实现振动成像。光声成像的优势在于超声波在组织中散射远小于光，因此非常适合深层组织成像，能够达到毫米级别的穿透深度。
受激拉曼光热（Stimulated Raman Photothermal, SRP）显微镜
（2023年）结合了SRS的相干激发和光热检测，在光学澄清介质中比SRS更有效，且对激光噪声不敏感。
短波红外光热（Shortwave Infrared Photothermal, SWIP）和倍频光声（Overtone Photoacoustic, OPA）显微镜
利用分子振动的倍频（overtone）吸收，这些吸收波长落在短波红外（SWIR, 1000-2500 nm）窗口（2024年、2013年报道）。SWIR窗口相比近红外和可见光有更低的散射，相比中红外有更低的水吸收，因此是实现深层组织化学成像的理想窗口，SWIP已经实现了毫米级深度和微米级分辨率的成像（2024年）。
在空间分辨率方面，扫描式MIP通过逆向传播几何（counter-propagating geometry）和高数值孔径物镜，实现了300 nm的空间分辨率（2017年）。宽场MIP结合干涉散射技术，能够以每秒635帧的速度对单个病毒进行指纹识别（2023年）。
先进振动显微镜的魅力在于它在速度、分辨率和深度上都取得了显著突破，极大地拓展了其应用范围。
在速度上，前面提到的视频速率扫描（如CARS的视频速率成像）、高速线扫描（如MIP的每秒超过2千条线）和宽场成像（如对单个病毒成像达到每秒635帧）都让捕捉生命体内的快速动态过程成为可能。
