Cell | 突破！研究人员首次构建功能性人类羊膜囊体外模型，开启胚胎外发育研究新纪元

生物探索 · 公众号 · 生物 · 2025-05-20 16:35

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更令人印象深刻的是模型的高重现性。研究人员发现，约92%的聚集体都能在10天内形成充满液体的类羊膜囊结构。使用其他人类多能干细胞系（human pluripotent cell lines），如RUES2 hESCs，也观察到相似的高重现性。这意味着这个模型不仅能成功构建，而且非常稳定可靠。

整个构建PGAs的过程，除了最初48小时的二维预处理外，完全是在不含分化因子的基础培养基中进行的，这表明早期信号足以驱动后期的谱系规范和自组织，展示了分化中的多能干细胞卓越的自组织能力。

不仅仅是形状像：模型在细胞和分子层面有多“像”？

为了全面了解PGAs的细胞组成和分子特征，研究人员进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）、蛋白质组学（proteomics）和代谢组学（metabolomics）分析。

通过单细胞RNA测序，研究人员在PGAs中鉴定出9种不同的细胞类型群体，对应着不同的发育阶段。他们看到了类似表皮细胞（epiblast-like cells），表达NANOG、SOX2和POU5F1等核心多能性标记物。还有两群类似羊膜外胚层的细胞，表达ISL1、TFAP2C、TFAP2A和GATA3等标记物。随着时间推移，这些早期羊膜外胚层标记物表达逐渐下降，而GABRP和VTCN1等晚期标记物表达上升，提示羊膜在模型中经历了类似发育的进程。

此外，模型中还包含了四群表达胚胎外中胚层相关基因的细胞群体，它们构成了从类似表皮细胞到晚期中胚层的连续发育进程。早期胚胎外中胚层细胞表达MESP1、MIXL1、TBXT、GATA6等标记物；中期表达APLNR、GATA4、BMP4和LEF1；晚期则表达BST2、POSTN和COL6A3。这些标记物的表达模式与胚胎外中胚层规范过程中的瞬时表达报道相符。

更重要的是，单细胞数据还揭示了模型中存在两群类似卵黄囊的细胞群体——卵黄囊内胚层样细胞和卵黄囊内皮样细胞。卵黄囊内胚层样细胞表达SOX17、HNF4A和APOA1等标记物；卵黄囊内皮样细胞则表达CD34和PLVAP等典型内皮标记物。

为了验证这些细胞类型的鉴定，研究人员将PGAs的单细胞数据与已发表的人类胚胎（受精后约17天）和恒河猴胚胎的体内数据进行比较。结果显示，PGAs中的细胞类型与体内胚胎的细胞类型在转录组水平上惊人地相似，包括类似表皮、羊膜外胚层、内胚层（卵黄囊）、新生/晚期胚胎外中胚层（卵黄囊中胚层）的细胞群都能很好地匹配。

除了细胞组成，PGAs的功能性特征也与人类羊膜相似。羊膜在怀孕期间会产生大量蛋白质和代谢物，支持胎儿的生长和健康。研究人员分析了从PGAs内部（腔内液体）和外部（腔外液体）提取的液体成分。蛋白质组学分析显示，腔内液体和腔外液体的蛋白质组成存在明显差异。共鉴定出2915种蛋白质，其中2370种是腔内液体独有的，524种是共享的，21种是腔外液体独有的。功能富集分析显示，腔内液体富含与分泌和代谢过程相关的通路，而腔外液体则富含与细胞外基质（ECM）组织相关的通路。值得注意的是，腔内液体中富含许多已知与胎儿健康和生长相关的人类羊膜液因子，如热休克蛋白、HGF、G6PD、TGFB2和APOE等。这表明PGAs能分泌与天然羊膜液相似的蛋白质。

与已发表的人类和恒河猴羊膜液蛋白质组数据比较发现，PGAs的腔内液体蛋白质组成与它们有很高的一致性。例如，与已发表的人类羊膜液蛋白质组有768个共享蛋白质。虽然人类羊膜液的组成会随孕龄变化，且受到胎儿和母体相互作用的影响，但PGAs的高度共享蛋白数量表明它是研究不受胚胎和母体影响的羊膜液成分的有用模型。

代谢组学分析也支持了PGAs的功能相似性。腔内液体富含的代谢物，如Hex-2-ulose（肌醇、果糖或葡萄糖）、犬尿酸（kynurenic acid）、肌酸（creatine）、己醇（hexitol）和腺苷单磷酸（adenosine monophosphate）衍生物等，都被报道存在于人类羊膜液中。相反，腔内液体中的叶酸（folic acid）含量低于腔外液体和对照培养基，暗示PGAs对叶酸进行了代谢转化。与之对应的是，腔内液体中富含与叶酸生物合成和下游代谢过程相关的蛋白质，如DHFR、MTHFR、MTHFD1和MTR等。

综上， PGAs不仅在形态和细胞组成上与人类胚胎的羊膜和胚胎外组织相似，还能产生功能上类似人类羊膜液的蛋白质和代谢物。

谁是构建“温室”的关键“建筑师”？

为了深入了解羊膜形成的分子机制，研究人员分析了PGAs在胚胎外中胚层和羊膜外胚层谱系分化过程中，基因表达和转录因子活性（transcription factor activity）的变化。

通过轨迹推断分析（trajectory inference），研究人员确认了模型中从类似表皮细胞向胚胎外中胚层和羊膜外胚层谱系分化的轨迹。进一步的早期差异表达分析（earlyDE analysis）揭示了在谱系分岔点上发生显著变化的驱动基因。基于此，研究人员识别出潜在的胚胎外中胚层驱动基因簇（如RSPO3、BMP5、GATA6、HAND1等）和羊膜外胚层驱动基因簇（如GATA3、GATA2、TFAP2C、ISL1等）。

转录因子活性分析（SCENIC）也预测了这两个谱系的关键转录因子。对于羊膜外胚层，预测的关键转录因子包括GATA3、GATA2和TFAP2C等。

为了验证这些预测，研究人员进行了基因扰动实验。他们使用小干扰RNA（siRNA）敲低（knockdown）了候选基因，观察PGAs形态的变化。结果发现，敲低某些基因会损害PGAs的形成和生长，其中GATA3的敲低影响尤为显著，这强烈提示GATA3在羊膜形成中的重要作用。MSX2、POU5F1等其他基因的敲低也影响了模型的生长。相反，敲低其他基因（如SOX2和NANOG，已知为核心多能性因子）则加速了羊膜形成或导致PGAs更大。

为了测试GATA3是否足以驱动羊膜形成，研究人员使用激活型CRISPR-Cas9（CRISPRa）系统在hESCs中特异性激活了GATA3的表达。令人惊叹的是，即使没有进行通常用于构建PGAs的BMP4和CHIR预处理，仅仅激活GATA3就足以诱导形成充满液体的类羊膜囊结构，并且重现性很高。免疫荧光染色显示，这些由GATA3激活形成的结构同样包含了TFAP2C阳性的内层和GATA6阳性的外层。

这些结果确凿地表明，GATA3在PGAs模型中的羊膜形成过程中既是必需的（necessary）也是充分的（sufficient），并验证了该模型用于遗传学研究的潜力。