主要观点总结
活动局部化成像（ALI）技术以其惊人的清晰度帮助我们拨开大脑神经元活动的“迷雾”。这项研究揭示了ALI在神经元活动定位方面的突破性进展，通过亚像素精度记录，能够清晰分离在传统方法下被混淆的信号。此外，ALI还在小鼠海马区的实验中大放异彩，以细胞分辨率绘制出复杂脑节律的精细图谱，并揭示了相邻神经元对Theta振荡的相位锁定的显著多样性。这项技术的出现为神经科学研究带来了全新的视角和可能性。
关键观点总结
关键观点1: 大脑组织的散射效应对神经元成像的影响。
大脑组织的散射效应导致神经元的“光学足迹”非常宽广，使得在宽场成像中难以分辨独立的神经元。研究数据表明，单个神经元的平均光学足迹在成像深度140微米时可达约35微米，远超神经元间距，导致信号重叠严重。
关键观点2: ALI技术的原理和特点。
ALI技术利用神经元活动稀疏激活的特性，通过捕捉瞬时闪光、构建活动指纹、精准定位中心、绘制活动热图和智能聚类分离等步骤，实现神经元活动的精确记录。即使在神经元高度密集、信号严重重叠的情况下，也能准确捕捉单个神经元的活动。
关键观点3: ALI技术的优越性能和表现。
通过模拟和活体实验，ALI技术展示了其卓越的性能。即使在神经元间距小于光学足迹的情况下，也能准确分辨出独立的神经元。此外，ALI还能在活体数据中识别出超过100个密集标记的神经元，并准确区分相邻神经元的活动。与传统方法相比，ALI具有更高的细胞识别率、更低的交叉干扰和更纯净的动作电位。
关键观点4: ALI技术在海马区Theta振荡研究中的应用。
海马区的Theta振荡是学习和记忆的基础。ALI技术首次在精细的空间尺度上记录了数百个CA1锥体神经元的活动，并捕捉到了快速的振荡动态。研究发现，相邻神经元对Theta振荡的相位锁定存在显著的多样性，这是传统电生理学和钙成像无法实现的。ALI技术的出现为绘制theta相位锁定的精细空间图谱提供了可能。
关键观点5: ALI技术的未来发展。
未来，随着电压指示剂亮度和灵敏度的提升、去噪算法的开发以及光学切片显微镜速度的提升，ALI技术的局部化精度和信号分离能力将持续增强。此外，像素数量的减少将提供更快的成像速度，加速我们绘制大脑电压动态完整图谱的步伐。
正文
为了应对这一问题，一些现有算法如VolPy和SGPMD-NMF也尝试从电压成像数据中提取神经元活动。这些算法通常依赖于神经元的平均荧光强度或神经元之间的相关性来识别细胞。虽然它们在某些场景下表现良好，但在神经元高度密集、信号严重重叠的情况下，它们往往力不从心。模拟数据显示，当两个神经元的间距小于其光学足迹的宽度时，这些算法就无法准确地检测出两个独立的神经元，而是将它们的信号合并为一个，导致提取出的活动轨迹是两个神经元信号的混合体。这使得在真实、复杂的神经网络中，要准确捕捉单个神经元的活动，变得异常困难。
ALI的巧妙之处在于，它并没有试图直接“磨平”散射造成的模糊，而是利用了神经元活动本身的一个关键特性：
尽管神经元在空间上分布密集且信号重叠，但在任何给定时刻，只有少数神经元会发射动作电位。
这种稀疏激活（sparse activation）的特性，为ALI提供了“逐个击破”重叠信号的机会。
ALI的原理与局部化显微镜非常相似，后者通过分时激活稀疏分布的荧光分子，并精确确定每个分子的中心位置，最终“拼凑”出超越光学衍射极限的超分辨图像。ALI将这一思想应用到了神经元电活动成像中：
捕捉“瞬时闪光”：
首先，研究人员对原始的荧光图像进行高通滤波，突出显示那些由动作电位引起的快速荧光变化。这些变化被视为“瞬时闪光”，代表了神经元的活动。通过检测这些荧光信号的峰值，研究人员能够捕捉到所有动作电位的发生时刻。
构建“活动指纹”：
对于每一个检测到的动作电位，研究人员会提取其峰值时刻的荧光变化图像，称之为“AF图像”（AF image）。这些AF图像本质上就是动作电位发生时，特定神经元激活所留下的“活动指纹”。为了进一步提高信噪比，研究人员还采用了奇异值分解（SVD）进行去噪处理。
精准“定位”中心：
接下来，ALI的核心步骤来了。对于每个去噪后的AF图像，研究人员会通过计算荧光信号的质心（center of mass localization），以亚像素（subpixel）的精度确定该动作电位发生时的精确中心位置。即使在宽场图像中，一个神经元可能覆盖了数十个像素，但ALI能够将动作电位发生时的核心激活区域定位到单个像素以下，实现超高的局部化精度。
绘制“活动热图”：
将所有动作电位的中心位置累积起来，研究人员就构建了一幅“动作电位密度图”，也就是所说的ALI图像（ALI image）。在这幅图中，亮度越高，表示该位置发生动作电位的可能性越大。ALI图像就像一张高精度的“神经元地图”，清晰地显示出不同神经元活动的核心区域。
智能“聚类”分离：
通过简单的峰值检测算法，ALI图像中的密集动作电位点被自动分组为独立的“簇”（clusters）。每个簇代表一个独立的神经元。在研究展示的示例中，宽场图像中模糊不清的区域，通过ALI能够清晰地分辨出四个不同的神经元簇，这种分辨率提升达到了惊人的“数倍”，甚至在某些情况下，比神经元的光学足迹小了“十倍以上”！这意味着，典型光学足迹宽度为34微米的神经元，通过ALI的精确质心定位，其活动核心区域的“表观大小”可以缩小到约3.2微米！
提取“纯净”活动轨迹：
一旦确定了每个动作电位所属的神经元簇，研究人员就能平均每个簇的AF图像，得到每个神经元的“纯净”光学足迹。然后，利用最小二乘回归（least-squares regression）方法，将原始图像数据分解为各个神经元的活动轨迹。这些轨迹不仅包含了动作电位信息，还能揭示亚阈值（subthreshold）电压动态。研究结果显示，通过ALI提取的活动轨迹，不同神经元之间的交叉干扰极低。即使是那些在宽场图像中看起来像是同一个点的神经元（比如研究中提到的簇a和簇b），ALI也能将它们的活动清晰地分开，彼此之间的干扰几乎可以忽略不计。此外，提取出的神经元自相关图（auto-correlograms, ACGs）清晰地显示出不应期（refractory period），这与真实神经元的生理特性高度一致，进一步证明了信号的纯净度。
这项研究通过严谨的模拟和活体实验，充分展示了ALI相对于现有算法的卓越性能。
研究人员模拟了两个具有固定光学足迹大小（宽度为w）的神经元，并系统性地改变它们之间的间距（s），从1.25w逐渐缩小到0.25w，模拟神经元间重叠程度的增加。
当间距s ≥ w时（即重叠不严重时），包括VolPy和SGPMD-NMF在内的所有算法都能成功识别出这两个神经元。
然而，当间距s < w时（即重叠超出散射极限时），VolPy和SGPMD-NMF算法开始“失灵”，它们无法检测出两个独立的神经元，而是将它们合并成一个，导致提取出的活动轨迹是混合信号。
而ALI，即使在最极端的0.25w间距下，依然能够准确分辨出这两个模拟神经元！它忠实地恢复了两个神经元的“光学足迹”，并提取出与真实活动轨迹高度匹配的信号。这无可争议地证明了ALI在处理高度重叠神经元信号时的超凡能力。
