正文
早期研究表明，野生型蛋白A在用0.5 M NaOH处理15分钟后仍保持约99%的结合容量，对于蛋白基试剂来说这是相当可观的，但仍然不足以在稳健且要求苛刻的工业应用中重复使用。在高pH条件下最易受到影响的残基是天冬酰胺，因为它倾向于发生脱酰胺或在高pH下加速的主链断裂反应。谷氨酰胺也被认为对高pH有一定的敏感性，但远低于天冬酰胺。
在设计Z结构域以使其对羟胺切割稳定时，同时通过Gly29Ala替换移除了一个特别易受碱影响的Asn28-Gly29基序。然而，Z结构域含有八个天冬酰胺残基，主要的蛋白工程工作集中在将这些残基替换为其他残基，以获得更耐碱的变体。给定残基对修饰的敏感性取决于序列和构象，因此不仅难以预测，而且难以在已经相对稳定的蛋白A序列背景下进行测量。大多数工程工作都是基于与现有的蛋白A基结构域或多聚体亲和配体的相对经验比较。天冬酰胺残基对碱敏感性的重要性通过蛋白A结构域的第23位残基得以体现。除了C结构域是苏氨酸外，所有结构域在该位置都有一个天冬酰胺残基。这使得C结构域成为所有野生型蛋白A结构域中耐碱性最高的。C结构域固有的碱稳定性启发了其在多聚体形式中用于抗体纯化的应用。
对Z结构域中的八个天冬酰胺中的七个进行系统评估表明，替换Asn23对增加碱耐受性最为有益。由于其位于接近N端的无结构区域，且该区域在多聚体配体中可以轻松重新设计，因此未包括天冬酰胺3。这项研究基于绕过突变策略，使用了结构上不稳定的Z结构域变体（Phe30Ala），以便更容易地检测出使用更稳定模板结构域时难以测量的微小稳定性差异。一般来说，只观察到对亲和力有轻微影响，对二级结构含量没有明显影响。
通过监测一系列突变体在连续15次IgG纯化循环中的结合容量，这些Z结构域变体被固定在填料上，并在每次运行之间使用30分钟0.5 M NaOH清洗方案。数据显示，Asn6、Asn11、Asn43和Asn52残基对碱依赖的结合容量损失并不重要，因为它们的表现与单独的Phe30Ala突变体相似。一个可能的解释是它们位于或靠近螺旋区域，这些区域的灵活性较低，因此不易受到修饰。
然而，Asn43Glu与IgG结合能力的降低有关，这一结果在后来的一份报告中被提及，这表明需要考虑不同参数之间的复杂相互作用。Asn23Thr突变体与单独的Phe30Ala相比显示出最显著的改进，这种特定的替换也已被证明可以增加Z结构域的稳定性，尽管以对IgG结合能力的轻微降低为代价。在基于Z结构域的工程结合蛋白（称为affibody分子）的优化结构框架中，Asn23Thr通常与Asn3Ala和Asn6Ala结合使用（图2.2A），后两者主要与增加储存稳定性和降低侧链修饰风险有关。与Asn23Thr不同，Asn21Ala替换导致在与对照Phe30Ala相比的碱暴露后结合容量明显下降。Asn21变体的不良表现表明，这个位置需要特别关注，其敏感性可能归因于其位于一个暴露的环状区域，而不是其侧链的化学组成。
总的来说，这些研究表明，有几种结构上兼容的替换可供考虑，共识设计方法非常适合合理工程目的。例如，关注组氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和苏氨酸等残基，这些残基在野生型序列中代表天冬酰胺的替换，已被用来构建一个耐碱的四聚体Z结构域变体，携带Asn3His、Asn6Asp和Asn23Ser替换。有趣的是，也有例子表明，非天冬酰胺残基的替换被证明可以进一步增强碱抵抗力，例如，C结构域中Gly29Trp修饰的域比Gly29Ala具有更强的耐碱性。
在基于蛋白A的色谱法中实现更温和的洗脱条件
尽管蛋白A纯化具有出色的特性，并且被广泛用于IgG和Fc融合蛋白纯化过程中的初始捕获，但为了洗脱而需要打破蛋白A与抗体之间的强相互作用所需的酸性pH是一个主要缺点。通常使用柠檬酸、甘氨酸或醋酸缓冲液在pH约为3.5的条件下从蛋白A柱中洗脱IgG。低pH可能导致抗体聚集，这是一个问题，因为聚集可能导致蛋白失活或引发免疫反应，因此需要将其降至最低限度。有多个报告涉及该主题，表明低pH暴露是抗体和Fc融合蛋白聚集的关键决定因素。不同抗体之间的聚集程度有所不同，某些亚类，如IgG4和IgG2，据报道比其他亚类（例如IgG1）更容易聚集，而IgG1似乎更容易降解。尽管IgG1是目前用于治疗性抗体的最常用亚类，但也有基于IgG2和IgG4的获批疗法。
研究表明，使用蛋白A进行酸性洗脱的纯化过程比仅使抗体暴露于低pH环境会加速抗体聚集。此外，据报道增加盐浓度会进一步增加聚集。关于缓冲剂的作用，已有不同的数据呈现，其中在一个案例中，柠檬酸被报道比醋酸和甘氨酸导致更高的聚集率，而另一项研究则表明，缓冲剂的浓度而不是缓冲剂本身是蛋白质聚集的主要贡献因素。
此外，据报道中和步骤中所用碱的种类对聚集程度也很重要。此外，洗脱后的高温暴露也可能影响聚集，这解释了为什么限制洗脱池在高温下的保持时间很重要。对于某些抗体，尤其是酸敏感的Fc融合蛋白，这些问题可能会排除蛋白A色谱法作为纯化的选项。因此，大量的研究工作致力于蛋白A结构域的工程改造，以及寻找替代的洗脱缓冲液组成，以提高从蛋白A基填料所需的洗脱pH。
值得一提的是，低pH并非只有负面影响，它通常被包含在纯化过程中作为病毒灭活步骤。病毒去除确实是生物治疗药物纯化过程中的一个重要部分，如前所述，也有报告声称实际的色谱步骤，而不仅仅是低pH本身，对聚集率有影响。在这种情况下，温和洗脱后的低pH保持可能是病毒灭活的替代方案，同时避免蛋白质聚集。如果整个纯化过程中要避免低pH，则可以通过病毒过滤、阴离子交换色谱或使用洗涤剂等替代方法进行病毒清除。
已经描述了多种方法来改善蛋白A色谱法中的洗脱条件，这有望扩大蛋白A纯化在对酸更敏感的抗体以及含有Fc的蛋白质中的应用范围。
洗脱缓冲液添加剂以实现更温和的洗脱
一种增加洗脱缓冲液中目标蛋白洗脱pH或降低聚集倾向的方法是使用添加剂。精氨酸是一种常见的蛋白质复性促进剂，将0.5-2 M精氨酸或其衍生物乙酰精氨酸和精氨酸胺分别添加到洗脱缓冲液中，已被提议可以将洗脱pH提高到4-4.3。其他建议的添加剂是1 M尿素，据报道可以减少聚集，但在报道的案例中对洗脱捕获抗体所需的pH没有影响。Ejima等人表明，添加1-2 M盐酸胍可以将洗脱所需的pH提高到4.3。然而，洗脱产品显示出聚集，与低pH洗脱后的聚集量相似。还评估了其他氨基酸作为添加剂，如赖氨酸、脯氨酸和甘氨酸是否可以改善洗脱pH，但这些氨基酸对洗脱抗体所需的pH没有影响。
此外，添加丙二醇被认为可以积极影响聚集率，但据报道反而增加了一种特定Fc融合蛋白的聚集含量。从上面的例子可以看出，改变缓冲液组成可以在纯化过程中对洗脱pH和/或聚集率产生影响，但效果可能难以预测。虽然这些不同的添加剂可能对某些聚集倾向的抗体或Fc融合蛋白的纯化有益，但效果可能因要纯化的蛋白质而异，需要针对每个纯化过程进行评估。尽管已证明精氨酸添加可以提高洗脱所需的pH，但高达2 M的浓度在大规模纯化过程中将非常昂贵。
结构工程以改善洗脱
由于蛋白A与IgG之间的高亲和力相互作用，可能通过降低这种亲和力来改变从蛋白A填料洗脱抗体所需的低pH。Gly29残基已被证明参与与含有VH3的抗体可变域的相互作用，并且当替换为丙氨酸时，可显著降低Fab结合。这种效应是使用基于Z结构域而非野生型蛋白A的配体的常见论据的基础，因为缺乏对可变区域的结合使得在略高的pH下实现更均匀的洗脱成为可能。因此，已经探索了Gly29的几种替换，以进一步降低Fab结合；特别关注Gly29Lys、Gly29Arg和Gly29Leu。为了扩大Z结构域衍生配体相对于野生型蛋白A的优势，通过在固有耐碱的C结构域模板中结合Gly29Ala、Ser33Glu和Asp36Arg替换，计算设计了合理突变体，以进一步降低VH3结合。
