Nature Biotechnology | 突破细胞类型限制：NIS-Seq开启基因筛选新纪元

生物探索 · 公众号 · 生物 · 2024-12-20 16:35

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b. 第一轮NIS-Seq成像结果与传统方法对比

图b比较了NIS-Seq与传统细胞胞质原位测序方法在八种细胞类型中的成像效果。结果显示，NIS-Seq在所有细胞类型（包括THP1来源的巨噬细胞和初级人巨噬细胞）中都能生成清晰的核内信号，而传统方法在某些细胞类型中未能产生足够的信号。这表明NIS-Seq在低转录活性和多样化细胞类型中的显著优势。

c. 14轮NIS-Seq测序的原始图像

图c展示了THP1细胞经过14轮NIS-Seq循环测序后的原始图像。实验中在第1、4、7、10和13轮进行了核染色，结果显示每轮测序的核内荧光信号清晰且稳定，表明NIS-Seq能够在多轮测序中保持高分辨率和可靠性。

d. 定量分析核内信号强度

图d对THP1细胞的两个核（Nucleus I和Nucleus II）进行了定量荧光信号强度分析。信号强度和碱基读取结果与条形码序列库中的两个条形码匹配，验证了NIS-Seq在条形码识别上的精准性。

e. 细胞条形码映射率

图e分析了细胞映射到已知条形码库成员的比例。结果表明，在使用NIS-Seq时，高达96.6%的细胞条形码能够被精确映射，而对照组（使用随机排列条形码参考库）中几乎没有信号。这表明NIS-Seq在条形码匹配上的高特异性。

f. NIS-Seq的特异性和灵敏度

图f通过混合细胞实验（表达GFP或NIS-Seq条形码的细胞）评估了NIS-Seq的特异性和灵敏度。实验对比了标准NIS-Seq方法和PFA固定后的改进版，结果显示NIS-Seq在两种固定方法下均能保持极高的特异性和灵敏度。

g. NIS-Seq的基因文库覆盖率

图g将NIS-Seq检测到的基因条形码与基于PCR的下一代测序（NGS）结果进行对比。结果显示，两种方法在基因库覆盖率上具有高度一致性，且相关性高达0.863，进一步验证了NIS-Seq的准确性和可靠性。

八种细胞类型的实验验证：一个技术适配性的突破

NIS-Seq技术的适配性和普适性在基因组筛选领域展现了令人瞩目的潜力。研究人员通过对八种不同类型的细胞进行实验验证，成功证明了NIS-Seq在多种生物学环境中的高效表现。这些细胞类型包括经典的实验室细胞系（如HeLa细胞）、肿瘤细胞（MaMel 65、B16-F1）、免疫细胞（THP1来源的巨噬细胞）以及极具挑战性的原代人巨噬细胞。结果表明，NIS-Seq在所有这些细胞中均能生成亮度极高且分辨率清晰的核内信号，无论细胞的转录活性或形态特性如何。

尤其值得一提的是，NIS-Seq在低转录活性细胞中的表现令人耳目一新。传统的基因组筛选方法在处理这些细胞时往往难以生成足够信号，导致筛选结果受限。而NIS-Seq通过直接在细胞核内对sgRNA的序列条形码进行转录、扩增和测序，有效绕过了对细胞转录活性的依赖。例如，在THP1来源的巨噬细胞和初级人巨噬细胞中，传统的原位测序几乎无法生成清晰的信号，而NIS-Seq却能够产生亮度显著增强的核内信号。此外，即使在高细胞密度的环境中，NIS-Seq依然能实现精准的细胞核映射，使得不同条形码能够被可靠地分配到正确的细胞。

数据进一步验证了这一技术的广泛适用性。研究表明，在所有测试的细胞类型中，NIS-Seq的条形码匹配率和灵敏度均显著高于传统方法。实验中，96.6%的已知序列库条形码能够通过NIS-Seq检测到，而传统原位测序在某些细胞类型中甚至完全丧失信号。这种技术的稳定性和普适性使得研究人员可以在从肿瘤细胞到原代免疫细胞的广泛环境中实施基因组筛选。

通过这次跨越不同细胞类型的实验验证，NIS-Seq不仅展现了强大的技术适配性，更为研究复杂的细胞系统、低转录活性细胞和原代细胞提供了一种高效、精准的工具。

高密度筛选的利器：NIS-Seq的精准度与可靠性

在基因组筛选中，高细胞密度实验一直是技术的试金石——如何在有限空间内精准分配和解读基因条形码信号，直接决定了筛选的成功与否。NIS-Seq凭借其独特的核内信号生成机制和高灵敏度，成为应对这一挑战的“利器”，在高密度细胞环境中展现了前所未有的精准度与可靠性。

传统的筛选方法在高密度条件下容易出现信号交叉或分配错误，因为这些方法依赖于胞质信号，而在密集的细胞环境中，胞质边界常常模糊不清。 然而，NIS-Seq通过在细胞核内生成强荧光信号，完全规避了这一问题。在实验中，研究人员利用NIS-Seq对THP1来源的巨噬细胞和其他类型细胞进行了高密度筛选测试，成功地在单核分辨率下映射了多轮测序产生的基因条形码。这一技术能够在核内信号的位置和颜色上做到精确匹配，即使在复杂的细胞排列中也能准确区分每个细胞的基因扰动条形码。

实验数据进一步凸显了NIS-Seq的可靠性。结果显示，在高密度条件下，NIS-Seq的条形码映射率达到 96.6% ，显著高于传统的原位测序方法。同时，特异性与灵敏度的测试表明，NIS-Seq在不同固定方法下（如甲醇和PFA固定）都能保持高水平的信号特异性（接近100%）和低噪声背景。此外，通过对混合细胞群进行测试，研究人员发现NIS-Seq能够清晰地区分表达不同sgRNA的细胞，几乎没有误报或信号重叠现象。